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1、第五章 细胞工程,主要内容：,3.1 细胞工程的基础知识与基本技术3.2 植物细胞工程3.3 动物细胞工程 3.4 微生物细胞工程,细胞工程：,细胞工程是指在细胞水平上进行的遗传操作，即研究、开发、利用各类细胞的工程。人们通过科学设计与精细操作，改变细胞的遗传基础，并通过无菌操作，大量培养细胞，使其再生成细胞、组织、器官乃至完整有机体，或生产出目物质的技术。,细胞工程的分类：,根据研究操作的对象不同，细胞工程又可分为三类，即植物细胞工程；动物细胞工程；微生物细胞工程。,第一节 细胞工程的基础知识与基本技术,一、细胞工程的基础知识 细胞是细胞工程操作的主要对象。生物界有两大类细胞：原核细胞与真核
2、细胞。,原核细胞,细菌、放线菌等的细胞属于原核细胞。原核细胞体积较小，DNA环状、不与蛋白质结合而裸露于细胞质中。胞内无膜系构造的细胞器。胞外由肽聚糖组成细胞壁，是细胞融合的主要障碍。原核细胞生长迅速，无蛋白质结合的DNA，易于人工遗传操作，是细胞改造的良好材料。,真核细胞,酵母、动物、植物等的细胞属于真核细胞。真核细胞体积较大、内有细胞核和众多膜系构造的细胞器。植物细胞有以纤维素和半纤维素为主要成分的细胞壁。真菌细胞壁主要由各种葡聚糖构成网状纤维物，还有甘露聚糖、蛋白质和脂质填充其中。真核细胞一般都有明显的细胞周期，处于有丝分裂时期的染色体呈现高螺旋紧缩状态，既不利于基因外钓，也难于插入外源
3、基因。,二、基本实验操作技术,（一）无菌操作技术 细胞工程的实验操作需要在无菌条件下进行，稍有疏忽都可能引致污染，导致实验失败。无菌室要定期用紫外线或化学试剂消毒，实验前后还应各消毒一次。无菌室外有间缓冲室，实验人员在此换鞋、更衣、戴帽，做好准备后方可进入无菌室。应注意周围环境的卫生整洁。超净工作台是最基本的实验设备，能满足较高的无菌要求。对生物材料要进行彻底消毒与除菌，实验所用器械、器皿和药品都应进行灭菌或除菌。,（二）细胞培养技术,细胞培养是指动物、植物和微生物细胞在体外无菌条件下的保存和生长。不同细胞的培养条件差异较大，但细胞培养过程有共同之处。,（三）细胞融合技术,两个或多个细胞相互接
4、触后，其细胞膜发生分子重排，导致细胞合并、染色体等遗传物质重组的过程称为细胞融合。,第二节 植物细胞工程,（一）植物组织培养的历史 植物组织培养 是在离体人工调控的条件下，培养、研究植物细胞、组织、器官，进而分化、发育形成完整植株的技术。,20世纪初，德国植物学家Haberlandt就曾预言“植物细胞具全能性”。但由于技术上的限制，离体培养细胞未能分裂。不久之后，Hanning成功地培育出能正常发育的萝卜和辣根菜的胚，成为植物组织培养的鼻祖。20世纪30年代，植物组织培养取得了长足的进展。我国植物生理学创始人之一李继侗、罗宗洛和罗士伟相继发现银杏胚乳和幼嫩桑叶的提取液能分别促进离体银杏胚和玉米
5、根的生长，据此证明维生素和其他有机物是培养基中不可缺少的重要组成成分。,1934年美国人White以西红柿根为材料，建立了第一个能无限生长的植物组织组培物。1956年Miller发现了激动素，并指出激动素能强有力地诱导组织培养中的愈伤组织分化出幼芽。这是植物组织培养中的一项重要进展。1958年Steward顺利地从胡萝卜的细胞培养中分化长出了胚状体乃至整株。从此以后，通过组织培养方法培育完整植株的探索便在世界范围内蓬勃开展。现在已有600多种植物能够借助组织培养的手段进行快速繁殖，多种具有重要经济价值的粮食作物、蔬菜、花卉、果树、药用植物等实现了大规模的工业化、商品化生产。我国的植物组织培养工
6、作起步较迟，但已经在多个方面取得了巨大成绩。,植物细胞工程,1、定义：,生物体的细胞具有使后代细胞形成完整个体的潜能的特性。,2、原理：,生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质，都有发育成为完整个体所必需的全部基因，从理论上讲，生物体的每一个活细胞都应该具有全能性。,3、差异：,（1）受精卵的全能性最高,4、潜在全能性的原因：,基因表达的选择性,（2）受精卵分化后的细胞中，体细胞的 全能性比生殖细胞的低。,一、细胞的全能性,已分化的植物细胞可以发育成一个植物体,二、植物组织培养,概念科学研究表明，处于离体状态的植物活细胞，在一定的营养物质、激素和其他外界条件的作用下，就可能表现出
7、全能性，发育成完整的植株。人工条件下实现的这一过程，就是植物组织培养。,二、植物组织培养,植物组织培养过程,二、植物组织培养,植物组织培养,(1)选择合适的外植体,外植体是指能被诱导产生无性增殖系的器官或组织切段，如一个芽，一段茎。选择外植体一般以幼嫩的组织或器官为宜，外植体的选择、外植体的去分化及再分化的最适条件都需进行摸索，他人成功的经验可供借鉴，并无快捷方式可循。,(2)灭菌,选择外观健康的外植体，尽可能除净外植体表面的各种微生物是成功进行植物组织培养的前提。消毒剂的选择和处理时间的长短与外植体对所用试剂的敏感性密切相关。通常幼嫩材料处理时间比成熟材料要短些。,植物组织培养的培养基 定义
8、：含有一定营养成分，供培养植物生长的基质 包括：矿质元素（大量元素和微量元素）碳源：蔗糖 琼脂：凝固剂 植物激素：生长素，细胞分裂素 维生素和有机添加物 条件：适宜的温度、PH、无菌,切取,接种,二、植物组织培养,植物组织培养过程,2、诱导去分化阶段,组织培养的第一步就是让外植体去分化，使各细胞重新处于旺盛有丝分裂的分生状态，培养基中一般应添加较高浓度的生长素类激素。去分化阶段为植物细胞依赖培养基中的有机物等进行的异养生长，原则上无需光照。但通常还是置于人工照明条件下培养，以期得到绿色愈伤组织。固体培养简便易行、占地面积小、可在培养室中多层培养。但外植体营养吸收不均、气体及有害物质排换不畅，愈
9、伤组织易出现极化现象。液体培养中，培养材料营养吸收及与环境的物质交换便捷，但需提供振荡设备，投资较大，且一旦染菌则难以挽回。,愈伤组织：离体的植物器官、组织或细胞，在人工培养基上由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞（细胞排列疏松而无规则、高度液泡化、无定形）。,二、植物组织培养,植物组织培养过程,3、继代增殖阶段,愈伤组织长出后经过46周的迅速细胞分裂与增殖，原有培养基中的水分及营养成分多已耗失，细胞的有害代谢物已在培养基中积累，因此必须进行移植，即继代增殖。同时，通过移植，愈伤组织的细胞数大大扩增，有利于下阶段收获更多的胚状体或小苗。,二、植物组织培养,植物组织培养过程,4、生根发芽阶段,
10、愈伤组织只有经过再分化才能形成胚状体，继而长成小植株。胚状体 是指在组织培养中分化产生的具有芽端和根端类似合子胚的构造。,试管苗,试管苗大规模培养,二、植物组织培养,植物组织培养过程,5、移栽成活阶段,生长于人工照明玻璃瓶中的小苗，要适时移栽到室外以利生长。此时的小苗十分幼嫩，移植应在能保证适度的光、温、湿条件下进行。在人工气候室中锻炼一段时间(称为炼苗)能大大提高幼苗的成活率。,移 栽,再分化形成的试管苗移栽到土壤中，可以发育成完整的植物体,2、植物组织培养,再分化,脱分化,愈伤组织,外植体,试管苗,植株,无菌环境下操作,细胞分裂素、生长素,细胞分裂素、生长素,固体蔗糖,细胞分裂素/生长素浓
11、度比值高，容易生芽细胞分裂素/生长素浓度比值低，容易生根,细胞培养图片,细胞培养图片,培养室,三、植物体细胞杂交,人类对自然界的认识总是不断地经历由表及里、由浅入深的发展过程。面对五彩缤纷的大干世界，人们往往不满足于自然界的种种恩赐。历史上曾有不少有识之士提出过，在不同物种间进行杂交，以期获得具有双方优良性状的杂种生物的美好设想。然而常规的杂交育种由于物种间难以逾越的天然屏障而举步维艰。科学家们受细胞全能性理论及组织培养成功的启示，逐渐将眼光转向细胞融合，试图用这种崭新的手段冲破自然界的禁锢。,1、定义：,用两个来自不同植物的体细胞融合成一个杂种细胞，且把杂种细胞培育成新的植物体的方法。,2、
12、优势：（与有性杂交方法比较）,打破了不同种生物间的生殖隔离限制，大大扩展了可用于杂交的亲本组合范围。,三、植物体细胞杂交,1960年该领域终于出现了重大突破。由英国诺丁汉大学Cocking教授领导的小组率先利用真菌纤维素酶，成功地制备出了大量具有高度活性可再生的番茄幼根细胞原生质体，开辟了原生质体融合研究的新阶段。植物细胞原生质体是指那些已去除全部细胞壁的细胞。这时细胞外仅由细胞膜包裹，呈圆形，要在高渗液中才能维持细胞的相对稳定。此外在酶解过程中残存少量细胞壁的原生质体叫原生质球或球状体。它们都是进行原生质体融合的好材料。,1973年Keller提出的高钙高pH法。第二年加拿大籍华人高国楠首创
13、聚乙二醇法(PEG)诱导原生质体融合；1977年他又把聚乙二醇法与高钙高pH法结合，显著提高了原生质体的融合率。次年，Melchers用 此法获得了番茄与马铃薯细胞融合的杂种。1979年Senda发明了以电激法提高原生质体融合率的新方法。由于这一系列方法的提出和建立，促使原生质体融合实验蓬蓬勃勃开展起来。,（一）原生质体的制备,取材与除菌酶解处理分离洗涤鉴定。,融合体,杂种细胞,去壁的常用方法：,酶解法（纤维素酶、果胶酶等）,原生质体融合方法：,物理法：离心、振动、电刺激等,化学法：聚乙二醇（PEG）,三、植物体细胞杂交,过程：,三、植物体细胞杂交,过程示意图,（三）杂合体的鉴别与筛选,双亲本
14、原生质体经融合处理后产生的杂合细胞，一般要经含有渗透压稳定剂的原生质体培养基培养(液体或固体)，再生出细胞壁后转移到合适的培养基中。待长出愈伤组织再按常规方法诱导其长芽、生根、成苗。在此过程中可对是否为杂合细胞或植株进行鉴别与筛选。,1、杂合细胞的显微镜鉴别2、互补法筛选杂合细胞 3、采用细胞与分子生物学的方法鉴别杂合体 4、根据融合处理后再生长出的植株的形态特征进行鉴别,白菜,甘蓝,白菜甘蓝,三、植物体细胞杂交,植物体细胞杂交应用,二、植物细胞培养和次生代谢物的生产,植物细胞次生代谢物质来源丰富 植物细胞在生理生化过程中会产生数量极为可观的次生代谢物质。目前已发现的植物天然代谢物已超过2万种
15、，而且还在以每年新发现1600种的速度递增。我们祖先在与疾病的抗争中已积累了丰富的利用植物中的生物活性物质治病强身的经验。李时珍(1593)编篆的巨著本草纲目中所开列的1892种药物绝大多数是植物。目前约25的法定药品来自植物。然而植物生长缓慢，自然灾害频繁。即使是大规模人工栽培仍然不能从根本上满足人类对经济植物日益增长的需求,案例,紫杉醇(Paclitaxel)是继阿霉素和铂类抗癌药之后本世纪后期最受人们重视的一种抗癌新药，是一新发现的有丝分裂抑制剂，其作用机理在于阻止微管正常生理聚集，抑制癌细胞的有丝分裂和纺锤体的形成，从而使癌细胞的复制受到阻断而凋亡。1967年美国化学家Wall和Wan
16、i等首先从太平洋紫 杉（短叶红豆杉，Taxus.brevifolia）树皮中提取出来。该药于1990年进入期临床试验，1992年底获美国FDA批准上市。,紫杉醇存在于红豆杉属植物的树皮、叶及茎中，其中树皮中的含量最高，大约从12000株成年紫杉树中才能提取1KG的紫杉醇，而且紫杉的生长周期很长，在世界分布很少。紫杉醇的国际市场价格为450美元/g,日本有关组织从红豆杉中诱导产生愈伤组织，筛选得到细胞培养4周就增殖了5倍，紫杉醇的含量达到了0.05，比树皮中紫杉醇的含量高达10倍。Ketchum从6种紫杉醇属植物中进行愈伤组织的诱导，获得了产生紫杉醇的高产细胞株，在悬浮培养下，细胞内的紫杉醇含量
17、超过了20mg/L。清华大学化工系生物化工研究所通过固液两步培养法可以在4周内获得20g/L干物质，利用代谢调控技术在23天内将紫杉醇的含量提高到0.063%左右。,2、利用植物细胞培养生产天然色素典型案例紫草宁,紫草宁可用作创伤、烧伤以及痔疮的治疗药物，同时又因为其漂亮的紫红色而作为高级色素使用。紫草宁产生于亚洲的多年生 植物紫草的根部。但紫草资源严重不足，在日本，紫草已濒临灭绝，在我国，紫草（Arnebia euchroma)列入了国际二级保护植物,紫草的人工栽培成活率低，而且直接提取紫草宁的无法满足市场需求。化学合成紫草宁的工艺非常复杂，且最终产率只有0.7，生产成本昂贵。紫草宁在国际市
18、场上售价高达7000美元/kg,1974年Tabata等就研究了用于培养紫草细胞的培养基。11981年Tabata和Fujita等又用大的培养容器进行细胞悬浮培养并获 得了紫草宁衍生物。日本在1983年进行紫草细胞大规模培养来生产紫草宁。我 国南京大学等从1986年开始对该项目进行研究，在进行大量的研究之后得出，在适当的条件下，培养的紫草细胞悬浮物中紫草宁含量占干重的14%，比紫草根中 的含量高10倍。,二、植物组织培养,植物组织培养应用举例（二）,五、人工种子的研制,人工种子 即人为制造的种子，它是一种含有植物胚状体或芽、营养成分、激素以及其他成分的人工胶囊。1978年植物组织培养学家Mur
19、alshige在第四届国际植物组织细胞培养大会上提出的设想。他认为科学已经发展到了这样的水平，科学家可以超越自然界的限制，用很少的外植体同步培育出许许多多的胚状体。将这些胚状体包埋在某种胶囊内使其具有种子的功能，并可直接用于田间播种。20世纪80年代初、美、日、法等国竞相掀起人工种子研制的热潮。我国虽然起步较迟，但人工种子的研究已被列入高技术发展计划，在胡萝卜、黄连、芹菜、苜蓿等植物中获得大量体细胞胚，人工种子在无菌条件下的萌发率已达 90以上。,二、植物组织培养,植物组织培养应用举例（三）,人工种子,（一）人工种子的构成及特点,1、人工种子的结构 人工种子是21世纪极具发展潜力和经济价值的高
20、科技成果，由以下三部分构成(图3-4)：,人工种皮 是包裹在人工种子最外层的胶质化合物薄膜。这层薄膜既能允许内外气体交换畅通，又能防止人工胚乳中水分及各类营养物质的渗漏，还应具备一定的机械抗压力。人工胚乳 是人工配制的保证胚状体生长发育需要的营养物质，一般以生成胚状体的培养基为主要成分，再根据人们的需要外加一定量的植物激素、抗生素、农药以及除草剂等物质，尽可能提供胚状体正常萌发生长所需的条件。胚状体 胚状体是由组织培养产生的具有胚芽、胚根等类似天然种子胚的结构，并具有萌发长成植株的能力。,2、人工种子的特点,人工种子的优点：可以不受环境因素制约，一年四季进行工厂化生产；由于胚状体是经人工无性繁
21、育产生，因此有利于保存该种系的优良性状；与试管苗相比，人工种子成本更低，更适合于机械化田间播种；可根据需要在人工胚乳中添加适量的营养物、激素、农药、抗生素、除草剂等，以利于胚状体的健康生长。,人工种子的缺点：,虽然人工种子的研制历经二十几年已经取得了长足的进展，但是仍有一些关键技术尚未攻克。人工种皮的性能尚不尽人意；还未找到一种符合多数物种需要的人工胚乳；胚状体如何让它处于健康的休眠状态；人工种子怎样做到既延长其保存时间又不明显降低萌发率等。不过有理由相信，不久的将来，人类终将摆脱大自然的羁绊，实现工厂化生产植物种子的目标。,植物组织培养技术的应用,种皮,胚乳,胚状体,第三节 动物细胞工程,动
22、物细胞工程 是细胞工程的一个重要分支，它主要从细胞生物学和分子生物学的层次，根据人类的需要，一方面深入探索、改造生物遗传种性，另一方面应用工程技术的手段，大量培养细胞或动物本身，以期收获细胞或其代谢产物以及可供利用的动物。,(1)细胞培养细胞(包括单个细胞)在体外条件下的生长称为细胞培养。在细胞培养中，细胞不再形成组织。,（2）贴壁依赖性细胞或培养物由他们繁衍出来的细胞或培养物只有贴附于不定化学作用的物体(如玻璃或塑料等无活性物体)的表面时，才能生长、生存或维持其功能。,3细胞传代培养方法：,分离细胞培养物：从温箱中取出瓶壁上铺满单层细胞的培养瓶，倒掉其中剩余的培养液，先用Hanks液洗二次，
23、加入胰酶（或EDTA）消化液，放入37C温箱(有的细胞可以不放)，时间可由几十秒至十几分钟，要根据细胞种类而定。,代：细胞以一个培养瓶移至另一个培养瓶，由此培养液有所稀释，即称为“一代”。,（12）传代无论是否稀释，将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶即称为传代或传代培养（13）原代培养以直接取自生物体细胞组织或器官开始的培养,（五）培养物的长期保存,培养物的长期保存方法基本上有两大类：经典传代法和冷冻保存法。1、经典传代法 Carrel是经典传代法的创始人之一和杰出代表，他在极简陋的条件下每隔几天把鸡胚心肌细胞传代一次。在令人难以置信的长达34年的时间里成功地无菌传代3400次。经典传
24、代法使培养物始终处于活跃生长状态，但手续较为繁琐，维持费用较高。,2、冷冻保存法,冷冻保存法具有操作简便、保存期长的特点。现以其中的液氮保存法为例简介如下：将成熟培养物(细胞)与510的甘油或二甲亚砜混匀，封装于若干个安瓿瓶中；缓慢降温(13min)至30；继续降温(1530min)至150；转移至液氮冻存，可无限期保存。若安瓿瓶置70冷存，保活期通常只有几个月。在90下培养物可保存半年以上。,一、冻存细胞的意义,1、长期保存细胞 2、防止细胞老化 3、实验本身的需要。如单克隆抗体实验,细胞污染的预防与检测,细菌、真菌、病毒、支原体或另一种细胞均可导致培养物污染。支原体尤其容易与细胞共生，极难
25、检测，因有些支原体需特殊的氨基酸，支原体的生长还可能导致培养基营养的专一性丢失。,常用抗生素：青霉素（200单位/mL）链霉素（200ug/mL）制霉素（100单位/mL）,支原体特别容易与细胞共生，极难检测卡那霉素（100ug/mL）是抗支原体药物，可抑制其感染，但不能根除 病毒感染：白血病C型病毒、多瘤病毒、乳腺瘤病毒等,对实验室工作者说来更严重的一种污染乃是其他细胞的交叉污染。为防止这种严重的细胞交叉污染，所有以事体外细胞培养的工作者都必须遵循这样一个原则：,在任何时间，在一个工作区中决不能有一种以上的细胞系的细胞同时存在。一种细胞系的细胞所用的培养基、器皿、移液管等决不能为另一种细胞系
26、的细胞所移用。一旦在同质的细胞群中出现不同形态的集落，则应怀疑是否发生了细胞污染，应用染色体组型及同功酶组型鉴定。,显著污染的标志是培养基pH值的迅速改变、细胞外形模糊、甚至出现漂浮的集落。污染通常表明操作者技术的失误或设备及用具上出了毛病。组织出现污染，可加青霉素200U/mL、链霉素200U/mL、和制霉素100U/mL。卡那霉素（100U/mL）是支原体药物，可抑制其感染，单不能根除。严格说细胞应该培养在物抗生素的培养基中，因抗生素对某些细胞有毒。,细胞融合是指两个或两个以上的相同或不同的细胞合并形成一个细胞的过程。细胞融合过程可以发生在体内或离体条件下。可以在自然情况下，如受精过程。更
27、多的是人工方法使两个不同的细胞融合，发生体细胞杂交，形成新的杂种细胞。故有人称融合细胞为杂种细胞,二、动物细胞融合,细胞融合示意图,动物细胞融合是研究动物细胞间遗传信息转移、基因在染色体上的定位、以及创造新细胞株的有效途径。动物细胞融合有以下三条途径：病毒诱导融合；化学诱导融合；电激诱导融合。,1病毒融合剂：,最早被采用病毒融合剂有疱疹病毒、天花病毒和副粘液病毒等在内的病毒类融合剂。灭活仙台病毒介导细胞融合过程可以大大提高融合频率。它在病毒类融合剂中最为有效，使用最广。这种病毒可进入细胞内，在邻近的细胞之间形成细胞质桥（cytoplasmic bridge）。,病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够
28、与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝集，细胞膜上的蛋白质分子和脂类分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。灭活是指用物理或化学手段杀死病毒、细菌等，但是不损害它们体内的有用抗原的方法。灭活的病毒既保留了诱导细胞融合的能力，又不会感染细胞。,2化学融合剂：,它们主要包括聚乙二醇（PEG）、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚甘油、溶血卵磷酯、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、甘油醋酸酯、油酸、油胺和二价阳离子载体等。其中则以PEG的使用最为广泛。,PEG 的作用,1、PEG可能使细胞膜（尤其是有丝分裂的骨髓瘤细胞）的脂类分子的物理结构发生重排，容易被PEG作用打开细胞膜，使细胞融合。2、PEG可能会把细胞膜
29、上的蛋白质分子排开，使脂质体扦入与膜结合。3、PEG可能作用于膜磷脂极性基团和细胞膜表面蛋白。使膜磷脂的表面电位下降，同时使膜糖蛋白的排阻体积减少，最终使膜出现缺口，进而融合。,3电融合技术：,电融合技术的原理：悬于大小不同的两平行电极间的低导电率溶液中的细胞，在1100MHz和1001000V/cm 的交流电场中，会向小电极移动，并极化成偶极子，而沿电场方向排列成串，此时再加上适当强度和持续时间的高压电脉冲、即可使相邻细胞膜的接触区产生可逆电击穿，从而触发细胞融合。,电融合技术的优点,只有小面积的细胞膜在电场的作用下产生暂时性的结构变化。整个过程是在室温和生理条件下进行的，因此，不存在影响细
30、胞活力的某些生理因素。异核体能够在光学显微镜下直接观察、跟踪、鉴定和收集培养，不要任何选择介质。,若进行大数量细胞融合能够快速而又近似同步的方式进行。杂交瘤产率相当高。这种方法适用广泛，亦可用于酵母，植物原生质体的融合。电融合突出的优点是对数量很少的细胞进行操作。,最大的不利之处是仪器的购置在融合大小不同的细胞时存在问题在融合膜成分不同的细胞时存在困难,电融合技术的不利之处：,四、细胞核移植与动物克隆,近年来，动物细胞核，尤其是哺乳动物体细胞核经移植到卵细胞后重新发育成一个幼体的研究正在不少国家争相开展。以下就这方面的工作做一简单介绍。,动物体细胞核移植技术将动物的一个细胞的细胞核移入一个已经
31、去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育成动物个体用核移植的方法得到的动物称为克隆动物,（一）细胞核移植,生物学家进行细胞核的移植实验基本上出于两方面的目的：1、异种细胞核质之间的遗传相互关系研究 本项研究的杰出代表是被誉为中国“克隆先驱”的童弟周教授和美籍华人牛满江教授。他们早在20世纪60年代就开展了鱼类核移植工作。他们取出鲤鱼囊胚期胚胎的细胞核，放人鲫鱼的去(受精卵中，结果有部分异核卵发育成鱼。经检查，这些鱼确为杂种鱼。它们的口须和咽区像鲤鱼，而脊椎骨的数目却像鲫鱼。侧线鳞片数为中间类型。血清及血蛋白的电泳分析都支持杂种鱼的结论。此外他们还进行了草鱼与团
32、头鲂等组合 的细胞核移植实验，均得到杂种鱼。它们有的为中间性状鱼，有的则偏像某一亲本。,2、脊椎动物克隆细胞核遗传全能性研究,几乎所有的真核生物细胞都有细胞核(个别种类已分化的细胞，如人红细胞除外)。那么，处于个体发育各个时期(如胚胎期和成年期)的细胞，履行不同职责的细胞(如乳腺细胞和小肠上皮细胞)，它们细胞核的遗传潜能是否一样?是否还具有遗传全能性?生物学家对此进行了孜孜不倦的探究。,什么是细胞全能性？,例一：非洲爪蟾实验,突变型蝌蚪肠上皮细胞 野生型未受精卵细胞 紫外线破坏细胞核 取出细胞核 无核的未受精卵（含有一个核仁）“重组细胞”囊胚 囊胚 蝌蚪 成蛙（细胞核含一个核仁）,已经分化的动
33、物细胞可以发育成为一个动物体,1981年，-menses率先报告用小鼠幼胚细胞核克隆出正常小鼠。1986年英国Willadsen等用未发育成熟的羊胚细胞的细胞核克隆出一头羊。至此，利用幼胚细胞核克隆哺乳动物的技术几近成熟，世界许多国家和地区，如美国、英国、新西兰、中国、日本、台湾等纷纷报道克隆成功猴、猪、绵羊、牛、鼠、山羊和兔等。其中，我国在20世纪80年代末克隆出一只兔，1991年西北农业大学发育研究所与江苏农学院合作克隆羊成功，1993年中国科学院发育生物研究所与扬州大学农学院共同克隆出一批山羊，1995年华南师范大学和广西农业大学合作克隆出牛，1996年中国农科院畜牧研究所克隆牛获得成功
34、。,核移植,胚胎移植,双目显微镜,显微操作仪,显微操作示意图,（二）体细胞克隆,不过最让生物学家和全世界震惊的重大突破是英国PPL生物技术公司和罗斯林(Roslin)研究所的Wilmut博士等人1997年2月27日在世界著名权威杂志自然宣布的用乳腺细胞的细胞核克隆出一只绵羊“多莉(Dolly)”的消息。“多莉”的诞生，既说明了体细胞核的遗传全能性，也翻开了人类以体细胞核竞相克隆哺乳动物的新篇章。此项技术因而荣登美国科学周刊评出的1997年十大科学发现的榜首。,仅仅过了一年，1998年新西兰、日本、法国的体细胞克隆牛相继出生。同年，一组科学家在美国檀香山宣布，他们用卵泡细胞的细胞核克隆的小鼠已被
35、再次克隆。“祖孙”三代22只克隆鼠组成的大家庭具有完全一致的遗传基础。2001年是中国克隆哺乳动物的丰收年。3月，中国科学院动物研究所生殖生物学国家重点实验室研究员、国家“家畜体细胞无性繁殖研究”项目首席科学家陈大元率领克隆动物研究小组开展克隆牛攻关。他们把牛异核卵发育至囊胚期的比例提高到 24-30，接着将230枚囊胚移植给112头受体牛，有26头妊娠，妊娠率232，但14头受体牛在怀孕过程中流产。,2002年初怀孕到期12头牛产下14头牛犊，大多自然分娩。其中9头克隆牛在出生后死亡，5头存活。上述实验宣告，我国已经成为继日本(1998年)、新西兰(1998年)、美国(2(00年)之后掌握体
36、细胞克隆牛等哺乳动物关键技术的少数国家之一。后来在同年第八届中国农业高新技术成果博览会的畜牧专题展上，一对健康活泼的“龙凤胎”山羊“欢欢”和“庆庆”特别引人注目，它们的妈妈是世界首批体细胞克隆山羊“阳阳”。“阳阳”是与一只经胚胎细胞克隆的山羊自然交配后生下这两个小家伙的。11月，山东省莱阳农学院以牛胎儿皮肤上皮细胞为供核细胞，成功地克隆了两只牛“康康”和“双双”。,由此看来，几个世纪以来人类梦寐以求的快速、大量繁殖纯种动物的夙愿，已经取得了重大的突破。那么，“多莉”绵羊是如何克隆诞生的呢?现简介如下(图3-7)：图3-7的克隆过程看似简单，其实，仅将乳腺细胞的细胞核植入已去核绵羊卵就重复了 2
37、77次；在体外培养这宝贵的异核卵时，仅有约十分之一(29个)具有活力，能生长至胚胎发育的桑椹期或囊胚期。把这29个早期绵羊胚分别植入13只代孕苏格兰黑脸羊母羊子宫中，最终仅产下羊羔“多莉”。如此低的成功率，既说明了实验的艰难，更反映出技术上的不成熟。,二、核移植技术,克隆羊培育过程,另一头绵羊的子宫,体细胞核移植 胚胎细胞核移植,供体细胞培养,（M卵母细胞）,减数第二次分裂中期,去核的卵母细胞,供体细胞注入去核卵母细胞,受体细胞激活，完成减数分裂、发育,胚胎移植,。这项登上世纪顶峰的成就必将对21世纪生命科学、医学以及农学等诸多领域产生重大的影响，如：遗传素质完全一致的克隆动物将更有利于开展对
38、动物(人)生长、发育、衰老和健康等机制的研究；有利于大量培养品质优良的家畜；经转基因的克隆哺乳动物，将能为人类提供源源不断的廉价的药品、保健品以及较易被人体接受的移植器官；科学家将很快地从目前的同种克隆技术推进到异种克隆，即借腹怀胎的新领域，这无疑将大大促进对濒临灭种的哺乳动物的保护工作。,回眸动物克隆史，我们清楚地看到了从利用早期胚胎细胞到成年体细胞的飞跃。在此基础上，克隆人已经不再是科幻小说中的故事了。鉴于担心极少数科学家擅自开展克隆人研究，1997年11月11日，联合国教科文组织第29届大会在巴黎通过一项题为世界人类基因组与人权宣言的文件，明确指出，违背人的尊严，用克隆技术繁殖人的做法是
39、不能允许的。1998年1月12日，欧洲法国、丹麦、瑞典、意大利、挪威、葡萄牙、罗马尼亚和西班牙等19个国家在法国巴黎签署了一项严格禁止克隆人的协议(European Protocol on Banning Human Cloning)。这是国际上第一个禁止克隆人的法律文件。这项协议规定，禁止各签约国的研究机构或个人使用任何技术创造与某一活人或死人基因相似的人，否则予以重罚。我国以及美、英、德、日等国政府也已明确表示反对克隆人。中国卫生部宣布，中国对克隆人研究不赞成、不参与、不资助，也不接受外来科学家从事这方面研究。,1998年初，美国哈佛大学69岁的Hid博士依然宣称，克隆人“只不过是人类生育
40、的另一项先进技术”。他我行我素地宣布，计划把自己的细胞核与捐献者的卵相结合后，再将这个胚胎植入他妻子CroXya的子宫，以期生下他的复制品。2001年1月，意大利世界著名的人类生殖医学专家Antinori和美国肯塔基大学的 Chawose教授公开宣布，他们决定实施全球第一个“克隆人”计划。2001年8月，An tinori宣称，他已经挑选了200对自愿者夫妇进行免费克隆人试验。2002年春，他甚至宣布，第一个克隆人、一位阿拉伯富商的儿子年底即将诞生!,存在的问题,。现在，尽管科学家已经初步掌握了克隆哺乳动物的技术，但毕竟还不够成熟，成功率还太低。它突出表现为怀孕成功率低；孕期流产率高，可达50
41、以上；围产期死亡率高；新生畜异常发育增多；出生后对环境的适应性较差以及可能早衰等。2002年，美国麻省理工学院的Yenes同夏威夷大学的柳町隆藏用基因芯片观察了克隆鼠的_kYY个基因，发现有高达数百个基因不正常。这个发现较好地解释了许多克隆动物在出生前和出生时非正常死亡的原因。,存在的问题,2003年2月，罗斯林研究所证实，“多莉”羊由于患进行性肺炎已经被实施了“安乐死”。据分析，绵羊通常能活到 1112岁，肺炎是老年绵羊常患的疾病。“多莉1996年7月5日出生，迄今未足7岁。它的死亡进一步引发了科学家关于克隆哺乳动物早衰的争论。在这种情况下进行人类的克隆不仅不科学，而且是不道德的。此外有关克
42、隆人的伦理道德规范也是个必须严肃探讨的问题。,六、干细胞研究,生老病死是自然界不可违抗的规律。人的死亡往往并不是全身各器官的功能都同步衰竭造成的，而是由于个别重要器官“难以胜任”，导致机体代谢紊乱所引起的，如肾功能衰竭引发尿毒症等。如果能更替这些受损的器官，我们就可以延年益寿。20世纪50年代，科学家在畸形胎瘤中首次发现了胚胎干细胞(embryonic stemcell，ES细胞)，从此开创了干细胞生物学研究的历程。1970年，Evans分离出小鼠胚胎干细胞并在体外进行培养。接着，科学家直接从病人的身上提取某种特殊的细胞使之长成皮肤、骨骼和软骨，甚至是重要器官的一部分，这些特殊的细胞就是干细胞
43、。1997年人的胚胎干细胞被首次培养成功，从而科学家开始了尝试“定制”器官救助生命的干细胞工程，即非繁殖性克隆或治疗性克隆研究。,干细胞(stemcell)是动物(包括人)胚胎及某些器官中具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞，是重建、修复病损或衰老组织、器官功能的理想种子细胞。按分化潜能的大小，干细胞基本上可分为三种类型：一类是全能性干细胞，即胚胎干细胞，是最原始的干细胞，具有自我更新、高度增殖和多向分化发育成为人体全部 206种组织和细胞，甚至形成完整个体的分化潜能。当受精卵分裂发育成囊胚时，内层细胞团的细胞即为胚胎干细胞。,另一类是多能性干细胞，这种干细胞具有分化出多种细胞、组织的潜能，但
44、却失去了发育成完整个体的能力，发育潜能受到一定的限制。如骨髓造血干细胞可分化成至少十二种血细胞，但一般不能分化出造血系统以外的其他细胞。还有一类干细胞为专一性干细胞，这类干细胞只能分化成一种类型或功能密切相关的两种类型的细胞，如上皮组织基底层的干细胞、肌肉中的成肌细胞等。不过，随着干细胞研究日新月异的飞速发展，最近也有科学家报道专一性干细胞也可能分化为其他类型的细胞和组织。,干细胞有以下显著的特点：具有分裂成其他细胞的可能性；具有无限增殖分裂的潜能；可连续分裂几代，也可在较长时间内处于静止状态；以对称或不对称两种方式进行生长。,上述干细胞研究不仅操作烦琐而且对实验者的实验技能要求很高。我国徐荣
45、祥教授等另辟蹊径，在皮肤干细胞原位再生方面取得了原创性的重大突破。他们对被烧伤的皮肤进行适当处理后，成功地直接诱导上皮组织基底层的干细胞分化生成皮肤细胞，使受伤的皮肤得以迅速康复。该技术显示我国干细胞研究已率先进入组织和器官的原位干细胞修复和复制阶段。,干细胞巨大的潜在应用价值引起世界许多国家和机构的高度重视，他们投入巨资进行研究，陆续取得了一系列重大的发现，以致1999年12月美国科学杂志将人类干细胞的研究评为当年十大科学成就之首。,政府、科学家和企业家已经从干细胞的初步研究成果中意识到其中莫大的发展潜力，导致干细胞研究异军突起，势头异常迅猛。我国科学家亦取得不错的业绩。理论上讲，干细胞可以
46、用于治疗各种疾病，但其最适合的疾病主要是组织坏死性疾病如缺血引起的心肌坏死，退行性病变如帕金森综合征，自体免疫性疾病如胰岛素依赖型糖尿病等。可以预期，不久的将来，人类将可以根据自己的要求“定制”所需的“部件”用于更替坏损或衰老的器官或组织，医治顽疾。从而使人类的平均寿命再向前迈出一大步。应用于细胞治疗疾病和传统方法比较具有如下优点：低毒性(或无毒性)，一次治疗有效；不需要完全了解疾病发病的确切机制；用自身干细胞移植，可避免产生免疫排斥反应。,不过，虽然胚胎干细胞具有十分诱人的理论研究和商业开发前景，但通常要毁损早期胚胎才可能获得胚胎干细胞。受精是生命的起点，胚胎是生命的开端。以窒息一个生命的代
47、价去挽救另一个生命是否值得？自从胚胎干细胞在1997年被分离出来后各国政府和科学家就展开了一场激烈的争论。克隆技术给法律、伦理、国家和社会安全等方面带来的冲击是空前的。,英国2000年通过了准许在严格管理的条件下克隆人类早期胚胎进行干细胞研究；美国总统布什在2001年8月宣布，美国政府将仅仅支持对已有的胚胎干细胞进行研究；德国不仅只允许研究 2002年1月30日以前产生的胚胎干细胞，而且还必须是在没有其他可选择的情况下才能进行。中国对胚胎干细胞研究，即治疗性克隆持支持态度。中国科学院副院长陈竺院士2002年7月指出：“一个体外的胚胎在有限的时间，如14天里，尚属一般的生物细胞，此时还没有神经细胞和脑细胞的产生，既无知觉也无感觉，因此科学界一般认为它在此时还不是一个道德意义上的人,
