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1、细 胞 应 激,（cell stress）,stress,细胞应激的概念,是细胞对环境因素导致大分子损伤的一种防御反应，目的是对抗伤害、修复损伤、增加对损伤的耐受性，以最终保护细胞和/或通过细胞死亡过程最终除去损伤后不能修复的细胞。,细胞应激反应的特点和基本模式,细胞的应激反应包括一系列高度有序事件。,细胞应激高度保守(细菌、酵母、植物、动物等都有)；,有害刺激/应激原,常见细胞应激的类型,（一）热应激（二）氧化应激（三）低氧应激（四）内质网应激（五）基因毒应激,（一）热应激（热休克反应）,1962年，Ritossa等将培养的果蝇幼虫由25移至30环境中，30 min后在果蝇唾液腺的多丝染色体
2、上观察到了蓬松或膨突(puff）现象，提示该区带基因转录加强,并可能有某些蛋白质合成增加。,生物细胞在热应激（或其他应激）状态下所表现的以基因表达变化为特征的一种防御适应反应称为热休克反应（heat shock response,HSR）。,1974年，Tissieres采用聚丙烯酰胺凝胶电泳从遭受热休克的果蝇唾液腺中分离出6种新的蛋白质，命名为热休克蛋白。,热休克蛋白（heat shock protein,HSP）,后来发现，除热休克外，许多对机体有害的应激因素，如低氧、缺血、活性氧、基因毒物质、ATP缺乏、酸中毒、炎症、以及感染等也可诱导HSP的生成，故HSP又被称为应激蛋白（stress
3、 protein，SPs）。,按照分子量分：Hsp110，Hsp90，Hsp70以及小分子量的Hsps按生成方式分：组成型和诱导型 与热应激关系最为密切的是诱导型的Hsp70。,HSP的分类,HSP的诱导,热休克、氧化应激、缺血/氧、重金属等多种应激原可激活热休克因子(heat shock factor，HSF)。HSF是参与热休克反应和诱导热休克蛋白表达的主要转录因子。活化的HSF三聚体转入核内，与靶基因启动子区中的热休克反应元件（heat shock response element，HSE）结合而诱导一系列基因，如Hsp70、Hsp90和Hsp27、HSBP1、IL-6、IL-10、细胞
4、泵如多药耐药1蛋白（ABCB1）等基因的转录。,HSP的诱导与调节,HSP的结构,HSP具有N端的高度保守的ATP酶区和C端的底物识别序列，后者易于结合蛋白质的疏水结构区。,HSP的功能,1.分子伴侣（molecular chaperon）,分子伴侣是细胞一类保守蛋白质，可识别肽链的非天然构象，促进各功能域和整体蛋白质的正确折叠。但自身并不成为被折叠的蛋白质的一部分。,已知多种应激原可导致蛋白质变性，使之成为伸展的(unfolded)或错误折叠的(misfolded)多肽链，其疏水区域可重新暴露在外，因而较易形成蛋白质聚集物，对细胞造成严重损伤。,HSP能识别和结合新合成的尚未折叠或因有害因素
5、破坏了其折叠结构的肽链结合，并依赖其N端的ATP酶活性，利用ATP促成这些肽链的正确折叠、移位、修复或降解。,HSP response to stress,泛素是一个使蛋白质降解的分子标签。机体在试图清除某些异常蛋白质（如变性蛋白、错误折叠蛋白等）之前，先将这些蛋白质标上泛素标签，然后经蛋白酶体将其降解。,2.调控蛋白转归,2004年10月16日瑞典皇家科学院将本年度诺贝尔化学奖授予以色列科学家阿龙切哈诺沃、阿夫拉姆赫什科和美国科学家欧文罗斯，以表彰他们在泛素调节的蛋白质降解研究领域中的卓越成就。,泛素碳端水解酶,泛素E3连接酶,作为损伤/危险相关分子模式(DAMPs)，通过模式识别受体，引发
6、炎症反应。,3.介导炎症反应,当机体受到损伤时，DAPM从支离破碎的细胞释放出来，这些成分，对于免疫系统来说，作为机体已受到损伤的危险信号。,DAPM为细胞的组成部分:如高迁移率族蛋白（HMGB1)；热休克蛋白；钙结合蛋白 S100等。,损伤/危险相关分子模式(damage-associated molecular patterns,DAMPs),外源性Hsp的功能,应激时，当HSP从受损细胞中释放出来时，这种Hsp作为危险信号”(danger signal)，能被单核/巨噬细胞、树突状细胞（DC）、血管内皮细胞上的模式识别受体所识别，导致细胞合成和释放出各种促炎因子，如NO、TNF-a、IL
7、-1、IL-6、IL-10等，增强细胞的免疫功能，并参与炎症反应。,（二）氧化应激（oxidative stress）,是由活性氧(reactive oxygen species,ROS)增多和/或清除减少导致ROS相对超负荷引起的细胞应激反应。,活性氧(reactive oxygen species，ROS)及自由基,氧自由基的生成,图.氧自由基的生成,体内ROS的清除,生理状态下，GSH/GSSG维持在高比率，而在氧化应激时，GSH氧化成GSSG，GSH/GSSG比率下降，故可借以评估脂质过氧化损伤情况。,在缺血缺氧、缺血再灌注损伤、化学性放射性损伤、炎症、肿瘤、重金属等病理情况下以及老化
8、等过程中，ROS产生增多，而清除能力不足，结果导致ROS和氧自由基增多。,ROS或自由基,通过靶基因起效应,激活转录因子,激活信号转导通路,MAPK和AKT通路等,清除ROS修复细胞损伤细胞凋亡,氧化应激,ROS激活的信号转导通路,MAPK家族成员，包括ERK、JNK和p38通路PI-3K/AKT信号通路PLC-PKC通路，PLC-Ca2+通路激活鞘磷脂酶（SMase）,紫外线、电离辐射、活性氧、细胞因子等 应激原?Rac,cdc42 Ras PAK/GCK MEKK1/2 MEKKs Raf MAPKKKSEK1/JNKK MKK3/6 MEK1/2 MAPKKSAPK/JNK p38MAP
9、K ERK1/2 MAPKc-Jun等 ATF-2 CHOP等 c-Myc等 转录因子,鞘磷脂酶（SMase）,Smase,中性Smase(细胞膜上),酸性Smase(溶酶体)。,ERK通路,细胞凋亡,促进细胞增殖炎症反应,SAPK/JNK,Nrf2-参与氧化应激的重要转录因子,在生理条件下，Nrf2与Keap1结合被扣押在胞浆，并易于被泛素化降解，因此Nrf2蛋白的半寿期只有20分钟，在细胞内维持低水平。在氧化应激过程中被激活的一些蛋白激酶，如ERK和p38以及PKC等可使Keap1和Nrf2磷酸化。导致二者结合的亲和性下降并与其解离，之后Nrf2转入核内与靶基因启动子中的抗氧化反应元件（a
10、ntioxidant response elements，AREs）相互作用，调节血红素加氧酶-1、谷胱甘肽S-转移酶A2和NAD(P)H醌氧还酶-1（NQO1）等靶基因的转录。,氧化应激激活的转录因子Nrf2,上述信号转导通路能够激活多种转录因子，如Nrf-2、NF-B、AP-1、ATF-2、NF-IL6等。诱导MnSOD、CAT和GSH-Px等的表达，从而清除ROS，具有特异性细胞保护作用。NF-B还能上调多种抗凋亡基因，如Bcl-XL,c-FLIP,cIAPs等的表达，发挥抗凋亡和促细胞存活的作用。,氧化应激激活的靶基因及生物效应,氧化应激也可以诱导细胞凋亡。如激活的JNK可通过激活转录
11、因子AP-1,上调具有促凋亡作用的基因表达，诱导细胞凋亡。JNK还能通过线粒体凋亡途径诱导细胞凋亡。NF-B也也可通过上调其具有促凋亡作用的靶蛋白，促进细胞凋亡。高浓度的ROS可攻击各种细胞成分,直接造成细胞结构损伤和功能代谢障碍，诱导细胞凋亡或死亡。,氧化应激后细胞的命运（存活还是死亡），取决于ROS的浓度、细胞的功能状态和整体的环境,由于在多种应激原（如低氧、基因毒）作用和炎症、缺血再灌流损伤等病理生理过程中都有ROS和自由基的生成增多，而在应激反应中涉及的基因几乎都受细胞氧还状态所影响。因此氧化应激反应是多种细胞应激反应中最中心的通路，参与了缺血再灌流损伤、炎症、肿瘤、衰老以及多种疾病，
12、如帕金森氏病、Alzheimer病、艾滋病、糖尿病血管并发症、心脑血管病等重要疾病的发生和发展过程。,三、低氧性应激(hypoxia stress),单纯性的缺氧或缺血缺氧可诱发缺氧性应激反应,细胞反应,缺氧,激活HIF-1和相关信号转导通路,低氧感受器,提高机体耐受缺氧能力,低氧应激,低氧感受器,1.含血红素蛋白假说 2.氧敏感性离子通道假说 3.NAD(P)H氧化酶复合物学说 4.线粒体逸出活性氧假说5.氨基酸羟化酶学说 6.乙酰转移酶学说 7.NO和CO学说,研究背景,EpoVEGFGLUT3ADM,缺氧诱导因子,VHL蛋白为E3-泛素连接酶的组成部分，在常氧下，它导致HIF-1的多泛素
13、化进而被降解。低氧能抑制VHL，使HIF-1稳定性增加，,VHL蛋白为E3-泛素连接酶的组成部分，在常氧下，它导致HIF-1的多泛素化进而被降解。低氧使HIF-1稳定性增加，增加的HIF-1与HIF-1以二聚体的形式转入核中调节靶基因表达。,EPO增多：红细胞生成增多VEGF增多：血管增生，使氧部位的血液增加iNOS增多：血管舒张（NO）GLUT1（glucose transport 1)和糖酵解酶增多 无氧酵解增强,HIF-1诱导的靶基因和生物效应,（四）内质网应激（endoplasmic reticulum stress）,真核细胞的内质网是细胞内蛋白质合成和折叠、Ca2+存储、脂质合成的
14、重要部位。各种原因，如缺氧、氧化应激、脂质过度负荷、病毒感染、药物和毒素等均可扰乱内质网稳态，导致内质网内未折叠蛋白或错误折叠蛋白积聚或细胞内钙稳态失衡，引起内质网应激，因此内质网应激是多种细胞应激反应的共同通路。,内质网应激的主要反应是未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR），当各种原因导致内质网内未折叠蛋白或错误折叠蛋白积聚时，为了减轻内质网的蛋白质过荷，细胞会启动（UPR）以恢复内质网的蛋白质折叠环境和稳态。,UPR包括：使蛋白质合成减少，以减轻未折叠蛋白的进一 步聚积；2.通过诱导伴侣分子（如HSP）和折叠酶的表达，增强内质网蛋白质的折叠能力；3.通
15、过激活泛素-蛋白酶体系统和自噬作用，促进错误折叠蛋白的降解；4.若通过上述反应仍不能缓解内质网异常蛋白堆积导致的内质网受压，将触发受损细胞凋亡或死亡。,目前已知的哺乳动物三条感受UPR的信号转导通路。它们上游是存在于内质网膜上起应激传感器作用的三个蛋白：1.跨膜蛋白活化转录因子6(activating transcription factor 6,ATF6)；2.双链RNA-依赖的蛋白激酶样内质网激酶（PKR-like ER kinase,PERK）3.需肌醇酶1(inositol requiring enzyme 1,IRE1)。,未/错误折叠蛋白反应的感受和信号转导,正常情况下，ATF6、
16、PERK 和IRE1与位于内质网的伴侣分子78kD的葡萄糖调节蛋白（GRP78）结合而处于失活状态。GRP78是HSP70同系物，当内质网中未折叠蛋白发生积聚时，作为分子伴侣，GRP78与未折叠/错误折叠的蛋白多肽结合而与ATF6,PERK 和IRE1解离，导致它们激活，从而将未折叠蛋白信号通过内质网膜传向胞浆和胞核。,未/错误折叠蛋白反应的感受和信号转导,图.未折叠蛋白反应信号通路介导的内质网应激和炎症反应,内质网应激的意义减少蛋白质合成，减轻未折叠蛋白的聚积；2.诱导伴侣分子和折叠酶表达，增强蛋白质折叠能力；3.促进错误折叠蛋白的降解；4.若通过上述反应仍不能维持内质网稳态，将触发受损细胞
17、凋亡或死亡。,迄今的研究表明内质网应激和未折叠蛋白反应与许多疾病，如糖尿病、神经退行性疾病、肿瘤、心脑血管病、病毒感染以及一些化学毒物引发的疾病都有关。,（五）基因毒应激（genotoxic stress）,由DNA损伤引起的细胞应激。,1.概念：,2.DNA损伤的原因,自发的DNA损伤；各种应激原的作用如紫外线、电离辐射、病毒感染、化学诱变剂等，导致DNA损伤。,DNA双链断裂（dsb）、DNA核苷酸加成物的形成和碱基修饰、DNA碱基错配和DNA单链断裂（ssb）。,3.DNA损伤类型,募集蛋白激酶，如DNA活化的蛋白激酶(DNA-PK)，PI-3K 样激酶（ATM和ATR）至损伤处,DNA
18、损伤传感器（DNA damage sensors）(蛋白复合物),细胞周期停滞损伤DNA的修复,激活下游酶和转录因子 如chk1、chk2 和P53等,4.DNA损伤激活的信号转导通路,DNA损伤（主要是双链DNA断裂）,(1)DNA损伤的信号识别,DNA活化的蛋白激酶(DNA-PK),调节亚基识别并结合到DNA双链断裂的末端，再与催化亚基结合并激活其活性，磷酸化转录因子如P53、c-Jun、c-Fos等而发挥作用。,ATM/ATR激酶,ATM和ATR属于PIKK家族,是DNA损伤检查点的主要成员.ATM和ATR在维持基因组的稳定性中起到至关重要的作用,毛细血管扩张性共济失调症突变蛋白(mut
19、ated in ataxia telangiectasia,ATM),ATM 和Rad-3相关蛋白（ATM and Rad-3 related，ATR）,1.磷酸化并抑制CDC25A（一种 参与细胞周期调控的磷酸酶）活性，阻滞细胞周期进展。2.磷酸化转录因子p53，导致其稳定性增加和激活。激活的P53能诱导多种与细胞周期停顿相关基因，如P21、GADD45 和MDM-2的表达。,DNA损伤激活ATM/ATR,它们进而磷酸化并激活下游的细胞周期关卡激酶2（checkpoint kinase，Chk2）和Chk1。激活的Chk1和Chk2：,以上结果导致细胞周期阻滞，为损伤DNA修复争取时间。,诱
20、导凋亡,1.P53诱导的细胞凋亡 如果的DNA损伤严重,不能修复，已磷酸化的P53在其 Ser46位可被进一步磷酸化。之后P53可诱导多种促细胞凋亡相关的基因，如Bax、Fas、p53 诱导蛋白（PIGs）、死亡受体5(DR5)等的表达，以及下调抗凋亡成员Bcl2和BclXL的表达，导致细胞凋亡。2.P53非依赖性细胞凋亡 NF-B也能诱导促凋亡蛋白，如Fas、DR4和DR5的表达，从而发挥促细胞凋亡作用。JNK,细胞凋亡的意义,清除基因受损细胞，防止突变细胞的扩散和肿瘤形成。,应激反应通路间的串话（cross-talk）,1.一种应激原,如ROS能可以引起多种细胞应激（氧化应激、内质网应激和基因毒应激）。2.不同应激原可以激活不同的信号通路和转录因子，基因毒应激-p53,热应激-HSF-1，低氧应激-HIF-1，氧化应激-Nrf2等；3.不同的应激原可激活相同的细胞内信号传导通路，如JNK和p38 MAPK通路，以及相同的转录因子，如NF-B。,4.在应激反应基因启动子上发生转录因子间的相互作用。这是由于很多相关基因的启动子上存在多个应激转录因子结合部位。例如氧化应激的反应基因Hmox1的启动子中不仅有Nrf2结合部位还有转录因子MTF-1、HIF-1、HSF-1和NF-B的反应元件，使它可对多种应激刺激发生反应。,实验说明：,1.分为5组,2.上课时间,
