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1、第六章 肽的人工合成,前言,20世纪初，fischer 创立蛋白质的多肽结构学说 1932年，Bergmann采用苄氧羰酰基作为氨基保护基 同时期Curtius创立酰氯法，叠氮法活化羧基的肽键生成法50年代初，Wieland等发展了活化酯法和混合酸酐法1953年，Vigneaud首次化学合成了多肽激素催产素1963年，Schwyzer合成24aa的促肾上腺皮质激素(ACTH)1965年，我国合成51aa的牛胰岛素1979年，矢岛治明液相法合成牛胰RNaseA(124aa)80年代，Merrifield提出固相合成法；多肽合成仪不断发展,第一节 肽化学合成原理和液相合成,基本步骤：1.-氨基和-
2、羧基以及侧链的保护 2.羧基的活化和肽键的形成 3.脱除保护基和纯化 Z2 Z1 Z2 Z1XNHCHCOOH+H2NCHCOOY H2O XNHCHCO-NHCHCOOY Z3 Z2 Z1 脱保护 XNHCHCOOH+H2NCHCO-NHCHCOOY Z3 Z2 Z1 缩合 XNHCHCO-NHCHCO-NHCHCOOY 保护基全脱除 三肽,一 氨基酸保护基,为了使肽键生成反应能够定向进行，需要对氨基酸的各种官能团进行保护（一）-氨基保护基：常用：烷氧羰基、酰基和烷基,（二）-羧基保护基,保护基种类相对较少-羧基保护基种类：盐：钾盐、钠盐、三乙胺盐、三丁胺盐等 盐是对羧基的临时性保护 酯：甲
3、酯和乙酯、苄酯、叔丁酯(最常用）（三）侧链的保护：20种aa中有13种侧链需要保护Lys-NH2 和侧链羧基:选择与-氨基和羧基不同的保护基 Cys-SH:甲基苄基、对氧苄基等（三氟乙酸铊/TFA脱除)羟基aa(Ser,Thr,Tyr)：苄基、叔丁基酰胺基保护：2,4,6-三甲氧苄基等（可用TFA脱除）,二 肽键生成法,基本思路：使-羧基活化为RCOX形式，加强羰基碳原子的正电性，便于-氨基进行亲和攻击而成肽（一）活化酯法：方法：采用巯基、烷基、酚基和N-羟胺类物质（最常用：N,N-二环乙基碳二亚胺，DCC)与N-保护aa作用，使-羧基活化为酯的形式，然后进行成肽反应。优点：中间产物可以分离、
4、结晶、保存，便于去除副产物 氨基组分的末端羧基可以不保护 对酰胺基活化特别有效,（二）缩合剂法：,重要的缩合剂：DCC,DIC(二异丙基DCC）等DCC接肽反应机理：,（三）叠氮法：,是最古老的经典肽键生成法(1902年），该法最少引起消旋 O O O R-C-OCH3 H2NNH2 R-C-NHNH2 R NO2 R-C-N3（酰化氨基酸酰肼）（酰化氨基酸叠氮）O H2N-R R-C-NH-R+碱 HN3 碱,（四）混合酸酐法：,50年代提出，简单、反应快、纯度好，尤其适合小肽合成 R1 R1 Z-NH-CH-COOH 叔胺(Et3N)Z-NH-CH-COO-Et3+NH R1 O O RO
5、-COCl Z-NH-CH-C-O-C-OR H2N-R2 成肽（存在副反应）,三 脱保护基及纯化,（一）TFA法：方法：将产物置于三氟乙酸(TFA)中处理，以脱除保护基优点：用于脱除一些不耐酸的保护基，温和，副反应少，尤其适合于固相合成法。曾用于胰高血糖素合成。缺点：TFA用量较大，需保护的氨基酸种类较多等（二）HF法：方法：以无水氟化氢(HF)在0 20C处理3060min优点：可脱除其他方法难以脱除的保护基，比TFA法有效缺点：HF腐蚀性强，脱除时副反应较多（三）含硅试剂法、有机磺酸法等,四 二硫键的生成,是蛋白质合成中最困难的工作经典方法：空气氧化法、碘氧化法，收率低，副反应严重目前:
6、三氟乙酸铊（(CF3COO)3Tl）法：可先裂解Cys的各种保护基，然后金属铊作为弱氧化剂催化二硫键的生成，效率是碘氧化法的2倍 亚砜介导法（sulfoxid-directed):Cys亚砜和CysR在酸处理下，生成的SH作用于亚砜的S原子，在亚砜位置处生成二硫键。用不同的Cys亚砜和酸处理，可在需要的位置定点生成二硫键。,五 合成肽的纯化和纯度鉴定,纯化：凝胶过滤、离子交换层析、反向HPLC等鉴定：薄层层析、等电点聚焦、分析HPLC、质谱法 等,六 肽的液相法合成策略与示例：,小肽合成：逐步延长法(stepwise elongation)，从C-端开始 逐一合成，使肽链向N末端延长的方法大肽
7、合成：片段缩合法(fragment condensation)，先分段 合成小肽再缩合成大肽段，缩合时常用不易消旋 的叠氮法片段缩合法策略：划分肽段：长度一般不超过10个aa残基 尽可能以不易消旋的Gly、Pro等为肽的C-端 aa和保护基性质对肽段纯化难异的影响 构象因素影响 选择接肽顺序：小片段分头缩和大片段肽(有时很难或不能进行)小片段逐一缩合(反应步骤多但产率高)较大片段逐一缩合（常用),示例：牛胰RNase A（124aa）的合成,将RNase A分成长短不一30个片段，分别以逐步延长法合成从肽的C-端开始，用叠氮法小片段依次接肽，得到保护的RNase A（N-端为Z(苄氧酰基)；C
8、-端，OBzl(苄氧基)）Cys(对甲氧苄基，Mbzl)和Met亚砜的还原，得到还原型保护的RNase A1mol/L三氟甲磺酸/TFA脱保护；巯基乙醇+二硫苏糖醇；过Sephadex G-25层析柱，得到去保护基的RNase A 在谷胱苷肽存在下空气氧化形成二硫键，Sephadex G-25，得到合成的RNase A 粗品(活力18.9%)经过亲和层析，产物活力81.3%CM-纤维素层析，得到离子交换层析纯产物95%乙醇处理，得到牛胰RNase A结晶，酶活力100%,第二节 固相肽合成,一、合成原理：1963年，Merrifield将aa的C-端固定在不溶性树脂上，然 后在其上依次进行氨基
9、酸缩合，延长肽链。克服了液相合成法中每一步产物纯化的困难，奠定了自动化肽合成的基础，为此，Merrifield于1984年获得Nobel化学奖固相法合成较之液相法简单、快速，不需每步纯化中间物 固相法适合1030aa的小肽，不流失 但固相法合成肽的纯度差，大肽或高纯、大量小肽合成采用液相法（一）Boc固相法（经典Merrifield法):因氨基保护基采用可用TFA脱除的Boc而得名;侧链用苄醇类保护；树脂为氯甲基化或羟甲基化聚苯乙烯,对乙酰氨基苄酯树脂,方法：Boc-NH-CHR1-COO-+Cl-CH2-树脂 C-末端aa与树脂结合：Boc-NH-CHR1-COO-CH2-树脂 用TFA法脱
10、除N-Boc CF3COO-+NH3-CHR1-COO-CH2-树脂 三乙胺中和、洗涤 NH2-CHR1-COO-CH2-树脂 在DCC存在下与Boc-aa耦联，洗涤 Boc-NH-CHR2-CO-NH-CHR1-COO-CH2-树脂 脱保护、重复接肽 Boc-NH-CHRn-CO-NH-CHR1-COO-CH2-树脂 全部保护基脱除，HF法等 目的肽,（二）Fmoc固相合成法：,Fmoc固相合成法的步骤与Boc固相合成法类似不同之处：氨基保护基为：可用碱(20%呱啶)脱除的芴甲氧羰基(Fmoc),侧链保护基为：可以用TFA脱除的叔丁基 树脂：采用90%TFA可切断的烷氧苄醇型 或1%TFA可
11、切断的二烷氧苄醇型优点：避免最终的强酸处理二、自动肽合成仪：1966年，Merrifield等报道了最初的自动肽合成仪一般以Boc或Fmoc固相合成法为基础，将肽合成自动化监测：Fmoc有明显的紫外吸收,第三节 酶促肽合成和半合成,一、基本原理：利用蛋白水解酶催化肽键的形成优点：反应条件温和；不引起aa消旋；不要求aa侧链保护；副产物少，后处理较简单1.酶促合成多肽的酶类：主要有四类：Ser蛋白水解酶；HS-蛋白水解酶；羧肽酶；金属蛋白酶类2.对aa成分的选择：为使反应向肽键生成方向进行,二 酶合成反应的几个系统：,为了使反应定向进行，将参与反应的氨基组分的羧基端和羧基组分的氨基端保护为提高合
12、成反应效率，防止二次水解，创建一些特定的反应系统，如：1.沉淀系统：降低产物溶解度，使其沉淀，防止水解 如：Z-Phe-COOH+Z-Leu-NH2 Z-Phe-Leu-NH2 在凝乳酶(200mol/L)催化下，PH7反应20hr，收率为70 80%。随反应进行溶液逐步变褐色，黏稠化、最终完全固化2.二相系统：将缓冲液与有机溶剂搅拌成乳浊液（二相系统，水相一般占25%），底物和酶在水的悬滴中反应，但生成的产物为脂溶性的。随着反应地进行，产物自动转移至有机相中，不再与酶接触。如：Z-Glu-COOH+Ala-ODPM Z-Glu-Ala-ODPM(二苯甲酯),三 酶促半合成：,对于无保护的大肽
13、段的之间的定向衔接，无法用化学法完成，但用蛋白水解酶的特异性可能取得成功 如：以枯草杆菌蛋白酶为催化剂，把化学合成的RNAase A小片段S-肽与天然水解大片段S-蛋白转化成半合成RNAase A取得成功酶促半合成胰岛素：猪胰岛素 羧肽酶A 去Ala胰岛素 胰蛋白酶 切除B链Ala30 在B30处接上叔丁氧基-Thr 酶促半合成人胰岛素（产率90%）,小结,肽合成方法：液相法 固相法（肽合成仪）酶促合成（半合成）法原理：基团保护，肽键合成，接肽，脱保护,蛋白质部分复习题,简述蛋白质的结构层次以及各层次主要的特点和存在类型。蛋白质一级结构测定的基本步骤和方法。研究蛋白质空间结构的主要方法有哪些？简述其原理。举例说明各种膜蛋白及纤维蛋白的结构特点。试述细胞内各种蛋白质跨膜运输的机理和途径。试述肌肉收缩的分子机理。简述肽人工合成的思路和常用方法。,
