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1、第三章 酶组织化学方法第一节概述,酶是生物体内具有催化作用的特异性蛋白质，细胞内新陈代谢的合成和分解的生物化学反应都有酶的参与，因此，又称其为生物催化剂。组织化学中的酶反应是指在一定的条件下，使组织细胞内的酶通过作用于酶的底物，使后者被分解形成某种初级反应产物，这种产物被捕捉剂所捕获而沉淀于原位上，然后将这种沉淀物变成具有可见性的最终产物，从而间接证明酶的定位。,酶酶的底物 最初的反应物另外物质（金属盐）不溶于水的显色产物,酶的分类：1.氧化还原酶：是催化氧化还原反应的酶。2.转移酶:是催化功能基团转移的酶。3.水解酶:是催化水解反应的酶。4.裂解酶:是催化分裂或合成化合物的酶。5.异构酶:是
2、催化同分异构体相互转化的酶。6.合成酶:是催化将两种物质合成一各物质,并必 须与ATP分解相偶联的酶。,酶组织化学反应中注意事项,在制备标本及组化实验中必须做到既要最大限度地保存酶的活性，又要保存好组织细胞的形态结构，以保证酶在组织细胞中准确定位。酶反应的温度、时间、PH必须控制好。试剂的浓度配制必须准确。所用器皿必须清洁，以防污染及出现假阳性。必须做阳性或阴性对照试验。,第二节 若干酶组织化学反应程序,一、碱性磷酸酶（一）名称：常用名：碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）水解酶，在碱性环境下催化水解磷酸脂生成磷酸和醇。在运输较为活跃的细胞膜上广泛分布，如毛细血管内皮
3、细胞、肝内毛细胆管膜、肾近曲小管的刷状缘、肠上皮的纹状缘和神经细胞的突触膜等。,(二)反应原理：,ALP在有激活剂（Mg 2+）存在和PH9.4时，将其磷酸盐底物（如一甘油磷酸钠、一苯酚磷酸钠）分解产生甘油钠和磷酸离子，后者被孵育液中的氯化钙所捕获，在有酶活性存在处生成磷酸钙沉淀，但为非金属盐，需要加入硝酸钴，从而生成无色磷酸钴沉淀，再通过硫化铵处理，形成棕黑色硫化钴。,（三）光镜显示法Gomori 改良钙钴法1）溶液的配制：孵育液：3甘油磷酸钠 10ml 2巴比妥钠 10ml 2氯化钙（2.7%CaCl22H2O）20ml 5%硫酸镁(MgSO47H2O)1ml 蒸馏水 5ml 调此液pH至
4、9.4,可冰箱保存。2硝酸钴（Co(NO3)2）0.5%硫化铵(NH4)2S)(新配),2)染色步骤:石蜡切片脱蜡入水,或冰冻切片或 经10%福尔马林固定 15min;入孵育液,37 30-40min(肾组织 10min,肝组织60min);流水冲洗5min;,2%（Co(NO3)2)5 min;蒸馏水洗;1%(NH4)2S 1 min;蒸馏水洗;甘油明胶封片;3）对照:孵育液中去除-甘油磷酸钠。4）染色结果：ALP活性的最终反应产物为棕黑色硫化钴沉淀。,5）说明：钙钴法在一般实验室仍是常用的方法，但因其化学反应多次转换，容易造成定位不准确；石蜡切片虽然也能显示ALP活性，但经石蜡包埋处理（包
5、括酒精、二甲苯、高温等），酶活性丧失大部分。,二、酸性磷酸酶（一）名称：常用名：酸性磷酸酶（acid phosphaatase,ACP）主要位于细胞内的溶酶体内，是溶酶体 的标志酶。此外，尚有非溶酶体性ACP。ACP在细胞退变过程中活性最强，在核酸和蛋白质代谢活动增强时，也见ACP活性增强。ACP也参与脂肪代谢。在神经传导冲动时，ACP参与Ca 2+依赖的神经递质释放过程。总之，在疾病、免疫反应和细胞损伤与修复过程中ACP均具有一定的生物学意义。,（二）反应原理,显示酸性磷酸酶，先将切片放入含有酶底物（-甘油磷酸钠）的溶液（PH5.0）中孵育，底物经酶水解，释放磷酸，用捕捉剂硝酸铅与磷酸反应，
6、形成微细的磷酸铅，沉淀于酶存在的部位，再用硫化铵处理，磷酸铅被置换形成粗颗粒状的黑色硫化铅沉淀物，便可用光镜看到。,（三）光镜显示ACP有铅法和偶氮偶联法：1、铅法：1）孵育液的配制：0.05mol/L醋酸盐缓冲液,pH5.0 10ml 蔗糖 0.8 g 硝酸铅 Pb(NO3)2 10mg 3%(约0.1mol/L)-甘油磷酸钠 1 ml按上述顺序加入,待硝酸铅完全溶解后再逐滴 加入底物,边加边搅至溶液完全透明。,2)染色步骤：石蜡切片脱蜡到水；冰冻切片或冰冻切 片冷福尔马林钙固定10 min后水洗；入孵育液24 h（肝组织1 h左右），37；双蒸馏水洗；入1硫化铵（新配）溶液内12 min
7、流水洗。,1 3）对照：在孵育液内加入0.01 mol/L氟化钠(NaF)抑制剂后,ACP 反应呈阴性。M 4）染色结果：ACP呈棕黑色硫化铅颗粒。5）说明：ACP是可溶性酶，以冷固定后结果 较满 意.石蜡切片制作过程易使酶 失活。,三、核苷酸酶（一）名称 常用名：核苷酸酶（Nucleotidase）,核苷酸酶是一种特异性的磷酸单酯酶，它能水解核糖核苷和去氧核糖核苷在5位置的磷酸酯，如一磷酸腺苷（），一磷酸肌苷（），尿苷磷酸（UMP）,胞苷磷酸（）等，水解产生核苷和磷酸，但不能分解甘油磷酸，葡萄糖磷酸。核苷酸酶是一种最适p值相当广泛的酶。,（二）反应原理,底物经酶水解，用金属离子捕捉生成的磷酸
8、离子而形成沉淀。即：腺苷磷酸水 腺苷磷酸。,（三）光镜显示方法 铅法（Wachs和Meisel 1956）（1）取材：新鲜组织冰冻切片（2）孵育液的配制：腺苷磷酸钠 4mg 0.2M Tris-苹果酸缓冲液（Tris-maleate buffer）p7.4 4ml 0.1M MgSO4(2.5%）1ml 2%硝酸铅 0.6ml 蒸馏水 0.4ml,（1）方法与步骤：新鲜组织冰冻切片,或冷10%福尔马林 固定冰冻切片;蒸馏水水洗;入孵育液,恒温37,孵育2060分钟;自来水洗;入1%硫化铵1分钟;蒸馏水冲洗;甘油明胶封固。,(4)结果与评价:棕黑色硫化铅沉淀为酶活性所在部位。(5)对照:可除去底
9、物,或以甘油磷酸钠代替底 物,或加入碱性磷酸酶抑制剂溴化四唑草 酸盐可防止杂入的碱性磷酸酶起作用。,四、葡萄糖6磷酸酶(一)名称 常用名:葡萄糖6磷酸酶（Glucose-6-phosphatase Phosphohydro-lase）,葡萄糖6磷酸酶是一种催化多种磷酸化合物水解的磷酸酶。例如它可以最快的速度催化葡萄糖6磷酸水解,也可以水解阿洛糖-6-磷酸、1,5-山梨醇聚糖-6-磷酸、甘露糖-6-磷酸、半乳糖-6-磷酸、核酸5磷酸及2-甘油磷酸,同时此酶还可水解焦磷酸、核苷三磷酸,果糖-6-磷酸、氨甲酰基-磷酸、磷酸烯醇丙酮酸、磷酰胺盐和某些其它焦磷酸化合物。,（二）光镜显示方法 铅法（Wac
10、hstei和Meisel 1956）（1）原理：葡萄糖6磷酸被释放出磷酸后，为硝酸铅所捕获，最终反应产物为颗粒状的硫化铅沉淀。（2）孵育液的配制：0.125%葡萄糖6磷酸钠 4ml 0.2M Tris-苹果酸（Tris-Moleate）缓冲液p6 4ml2%Pb(N03)2 0.6ml 蒸馏水 1.4ml 新鲜配制,充分混合后使用。,（1）方法与步骤：新鲜组织,冰冻切片,3%冷福尔马林固定5分钟;水洗；入孵育液,恒温37,孵育520分钟;水洗；入1%硫化胺1分钟;水洗；3中性福尔马林液后固定10分钟；甘油明胶封固。,(4)结果与评价:棕色硫化铅颗粒为活性所在部位。(5)对照:除去底物；以甘油磷
11、酸钠代替葡 萄糖6钠盐；以0.01M氟化钠作抑 制剂。,五、三磷酸腺苷酶(一)名称 常用名:三磷酸腺苷酶（Adenosine triphosphatase，ATPase）,(二)反应原理 ATP酶是分解ATP产生ADP和磷酸的酶。ATPase水解磷酸之间的高能键，释放大量的能量，而不是水解磷酸与碳之间的键。释放出来的磷酸离子被铅离子捕获，而通过形成硫化铅沉淀显色。最适p7.2。,根据ATP酶对激活剂、抑制剂的不同反应，以及超微定位观察，生物体内主要有三种三磷酸腺苷酶（ATPase）。1、膜ATP酶：又分为Na+、K+激活 ATPase 和Mg2+激活ATPase；2、肌球蛋白ATP酶：又称Ca
12、2+激活 ATPase，因为它可被Ca2+激活；3、线粒体ATP酶：由Mg2+激活的ATPase,（三）光镜显示方法 1、Mg2+激活的三磷酸腺苷酶铅法（1）原理：ATP酶分解ATP释放出来的磷酸离子被铅离子捕获，通过形成硫化铅沉淀显色。最适p值为7.2。,（2）孵育液的配制：三磷酸腺苷钠盐 5mg 0.2M Tris-盐酸（Tris-HCl buffer）4ml 2%Pb(N03)2 0.6ml 0.1M MgSO4 1ml 蒸馏水 4.4ml 配制时Pb(N03)2 要逐滴加入，并随时搅拌，使充分混合至无色或淡乳白色。,（1）方法与步骤：新鲜组织,冰切片；入孵育液，恒温37孵育2040分钟
13、 蒸馏水洗；入1%硫化胺1分钟;流水洗；甘油明胶封固。,(4)结果:酶活性处呈棕黑色硫化铅沉淀。(5)对照:除去底物，则反应为阴性；以甘油磷酸钠代替底物，显示染色反应为碱性磷酸酶的定位。,2、Ca2+激活的三磷酸腺苷酸 钙-钴法（肌球蛋白型ATPase Padykula和Herman 1995）（1）原理：此法类似碱性磷酸酶的钙-钴法，但底物改用三磷酸腺苷钠盐，最适p值为9.0，对Mg2+型ATPase起抑制作用。（2）孵育液的配制：三磷酸腺苷钠盐 60mg 0.1M巴比妥钠 4ml 蒸馏水 2ml 0.18M CaCl2 2ml 2,4二硝基苯酚 30mg,（1）方法与步骤：新鲜组织,冰冻切
14、片；入孵育液，恒温37孵育2040分钟 蒸馏水洗；1CaCl2溶液换洗三次，每次2分钟 蒸馏水洗；入CoCl2液5分钟;流水洗；入硫化胺液1分钟；流水洗；甘油明胶封固。,(4)结果与评价:硫化钴黑色沉淀为酶活性所在部位。(5)对照:同铅法，可除去底物或用甘油磷酸钠作底物。,六、非特异性酯酶（一）名称 常用名：非特异性酯酶Nonspecific esterase）(二)反应原理 随各种方法的不同，其原理不相同。,（三）、光镜显示方法1、偶氮色素法（偶联偶氮色素法）由于使用不同的重氮盐，具体方法也不相同，现分述如下：(1)萘酚AS乙酸盐（Naphthol AS acetate）法 1）孵育液的配制
15、：1萘酚AS乙酸盐（丙酮溶液）0.1ml 0.05磷酸缓冲液（pH 7.0）10ml 坚牢蓝B盐 30mg（搅拌过滤使用）,2）方法与步骤：新鲜组织恒冷箱切片，适当固定；入孵育液，室温或37恒温孵育2030分钟 流水轻冲洗2分钟；2甲基绿复染细胞核；流水冲洗35分钟；甘油明胶封固。3）结果与评价：酶活性部位呈黑色，胞核为绿色。活性部位的染色根据重氮盐的不同而不同，坚牢红TR为紫红色，坚牢蓝RR为青铜色。,七、脂酶（一）、名称 常用名：脂（肪）酶（Lipase）(二)、反应原理 脂酶又名甘油酯水解酶，它能催化长链脂肪酸甘油（或其它醇）酯水解，Ca2+、Sr2+、Mg2+、半胱氨酸、巯基乙酸和牛磺
16、胆酸盐（taurocholate）均能激活脂酶。,（三）、光镜显示方法1、硫化铅法（1）原理：以吐温为底物，在脂酶的作用下，分离出来的脂肪酸可与钙形成钙皂沉淀，进一步以铅置换钙，最后再经硫化铵生成棕黑色硫化铅沉淀。（2）孵育液的配制：5吐温60（或80）水溶液 2ml 0.2M Tris缓冲液（pH7.27.4）5ml 10%氯化钙 2ml 蒸馏水 40ml,（3）方法与步骤：将冰冻切片或福尔马林固定的冰冻切片 水洗 入孵育液，恒温37,孵育23小时；1%CaCl2 液内浸洗;1Pb(NO3)2浸15分钟;流水冲洗5分钟；0.50.1%硫化铵液内1分钟；水洗；甘油明胶封固。,(4)结果与评价：
17、磷酸黑色硫化铅沉淀为酯酶活性所在部位。（5）对照：去除底物吐温60（或80），反应即为阴性。,八、乙酰胆碱酯酶和胆碱酯酶(一)名称常用名:乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase),胆碱酯酶(cholinesl-eraes)(二)反应原理广义的胆碱酯酶可分为乙酰胆碱酯酶(AChE)和狭义的胆碱酯酶(ChE)两大类。二者的化学性质不同。用酯来检测底物特异性时，AchE能最快地促进乙酰胆碱分解，也能分解乙酰基甲基胆碱，但不能分解苯甲酰（基）胆碱，同时，此酶能被高浓度的乙酰胆碱所抑制，但是ChE则不同，乙酰胆碱浓度越高，越能被ChE所分解。,（一）光镜显示方法1、亚铁氰化铜法（1）原理
18、：利用乙酰胆碱酯酶能将乙（或丁）酰硫胆碱盐水解产生硫胆碱，使铁氰化物还原为亚铁氰化物，后者与铜离子结合成亚铁氰化铜（Copper ferrocy anide）而呈色沉淀。证明酶活性的存在。若用四异丙基焦磷酰胺(Tetra isopropyl pyrophospho ramide),抑制非特异性胆碱酯酶，就可以单独显示胆碱酯酶（AChE）。,（2）孵育液的配制：乙酰硫胆碱碘盐(acetyl thiocholine iodide)5mg 0.1M醋酸缓冲液pH5.5(acetate buffer)6.5ml 0.1M（2.94%）柠檬酸钠 0.5ml 30mM(0.75)CuSO4 1.0ml 蒸
19、馏水 1ml 5mM(0.164%)铁氰化钾(potassium ferricyanide)1ml 乙酰硫胆碱碘盐完全溶解于醋酸缓冲液后，依次入其他溶液，临用前不超过30分钟内配制，充分混匀至溶液呈亮绿色。最终pH 5.55.6。,（3）染色步骤：新鲜组织，冰冻切片；固定：冷丙酮或10福尔马林固定2025分钟；蒸馏水洗；入孵育液,室温或37，恒温孵育12小时；蒸馏水洗；甘油明胶封固。,(4)结果与评价：乙酰胆碱酯酶和胆碱酯酶活性部位均显示棕色（红褐色）沉淀。(5)对照：用四异丙基焦磷酰胺（ISOOMPA）4mM(0.137%)0.2ml抑制非特异性胆碱酯酶酶而显示乙酰胆碱酯酶(AchE)。用毒扁豆碱硫酸酯(eserine sulfate)3105M代替蒸馏水，将切片处理30分钟，水洗后再入孵育液内，则两种酶均被抑制而呈阴性。,
