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1、Waters HPLC色谱柱,Waters 色谱柱发展历史,Styragel,Bondapak,DeltaPak,1964,1979,1973,1992,Symmetry,Spherisorb,Atlantis,Symmetry 300,XTerra,XTerraPrep,1998,Nova-PakProteinPakTMPico-TagTM,SymmetryShield,1984,1986,2002,1999,1994,2003,Atlantis HILIC SilicaPrep OBDIntelligent SpeedTMBioSuiteNanoEase,2004,ACQUITY UPLC
2、 BEHSunFire Columns,PrepPak,1976,1958,Atlantis T3ACQUITY UPLC HSS T3AccQTagTM Ultra,2006,2005,XBridge,2007,ACQUITY UPLC HSS C18 and HSS C18 SB,2008,XBridge HILIC,2009,ACQUITY UPLC BEH AmideACQUITY UPLC BEH GlycanXBridge AmideXSelect HSS HPLC Columns,2010,ACQUITY UPLC BEH200 SECXSelect CSH HPLC colum
3、nsACQUITY CSH ColumnsViridis SFC ColumnsProteinPak High Rs IEX,AccQTagTM,2011,ACQUITY UPLC HSS Cyano&PFP columnsXSelectTM HSS Cyano&PFP columnsXP 2.5 m Columns,2012,ACQUITY UPLC BEH125 SECACQUITY UPC2,Waters公司是全球最大的色谱柱原生产厂家之一,内容,色谱柱应用基础HPLC色谱柱介绍色谱柱使用保养知识,内容,色谱柱应用基础HPLC色谱柱介绍色谱柱使用保养知识,高效液相色谱柱简介,色谱柱是一根
4、填满填料的管子柱管的材料(塑料,玻璃,不锈钢)和尺寸(内径,长短)不尽相同管内的填料更是种类繁多,主要分为三大类硅胶基质聚合物基质无机和有机硅胶杂化基质色谱柱的性能主要取决于填料的性质和填充技术,硅胶颗粒的形状,不规则形状(Irregular)大硅胶颗粒研磨，筛分不粒尺寸和表面积限制球形（Spherical）目前流行的分析填料形更好的性能，重现性,C18 填料的合成 1.硅胶基质的合成（多孔）,Tetraethoxysilane,(TEOS),Polyethoxysilane,(PEOS),硅胶颗粒基质,硅胶的孔结构,Si-OH=硅羟基(Silanol),注意：孔径是分布值,孔占据大于99%填
5、料表面,平均孔径/孔体积孔径/孔体积分布大的孔径可分析高分子量的分子,填料的孔（多孔式液相色谱颗粒）,130 and 3001.7 um BEH Particles（电镜照片）,必须允许流动相进入内孔以保证待分析和分离的化合物能够和色谱填料有保留,填料的合成 2.键合配体（键合相）,色谱填料是多孔颗粒（“海绵”），99发生色谱分离的表面是在内孔表面,Analyte,流动相,填料的内孔表面,+HCl,+,优点：键合密度高，样品载量大缺点：疏水性最强，对极性物质保留不佳；容易发生酸水解键和相流失,键合方式：单点键合,优点：酸性条件下键和相稳定性高（耐水解）,键合方式：三点键合,C18 填料的合成
6、3.端基封尾,键合相(配体)：C18,残留硅羟基,端基封口基团,硅胶基质,对色谱柱填料的了解(一),键合相化学影响化合物的分离度：不同键合相对不同种类的化合物分离不同可能导致色谱的分离机理不同如：C18、C8、CN,键合相色谱柱,以硅胶为基质，通过化学键合方式把C18、C8、NH2等基团联在基质上，作为固定相优点固定相稳定，不易流失应用广泛，可使用多种溶剂消除硅羟基的不良影响缺点pH值不能小于2(键合相水解)同样填料，各种牌号色谱柱不尽相同,带有内嵌极性配体的色谱填料,(由一步合成过程而来),Waters Symmetry Shield RP18,不同色谱填料的选择性差异,填料的品牌-不同硅胶
7、颗粒基质密度，表面积，孔径纯度(残留硅羟基活性不同)键合相的种类:C18,C8,Shield RP18不同 C18配体键合水平单键键合,双键键合,三键键合配体覆盖率(疏水性不同),选择性差异来源,对色谱柱填料的了解(二),填料的端基封口封口残余硅羟基减少不可逆吸附或拖尾增加碳含量（0.1%-1%）,残基处理的效果,NovaPak C18,未封口 C18,抗坏血酸 烟酰胺 对氨基苯甲酸 哌咯西叮 核黄素 苯酚 盐酸硫胺,对色谱柱填料的了解(三),含碳量含碳量越高，k值越大（固定相传质效应增加）高含碳量有利于不易保留的化合物的分离水解稳定性好，重现性好有利于极性化合物的拖尾改善低含碳量有利于分析中
8、性及碱性化合物降低溶剂损耗,不同色谱柱的含碳量,色谱柱 C%k苊(50/50的乙腈/水)Symmetry C18 1917Zorbax ODS 1715.7LiChrosorb RP-18 1510.3Symmetry C8 1212.5Resolve C-18 1212.4Ultrasphere ODS 1111.3Partisil ODS-3 1112.0mBondpak C-18 10 7.9Nova-Pak C-18 7 5.5,对色谱柱填料的了解(四),平均颗粒度，颗粒度分布颗粒度颗粒度越小：柱效越高(传质好，涡流扩散小)柱压越高(渗透性差)颗粒分布颗粒分布越宽:柱效低(渗透性差)颗
9、粒形状球型:柱效高、重现性好、柱床结构均匀无定型：柱床结构不均匀,流动相线性速度不均 匀谱带扩展,对色谱柱填料的了解(五),硅胶的活性主要影响碱性化合物的保留行为：k生产硅胶时处理温度不同，硅胶活性也不同是选择性差异的主要来源硅胶的杂质含量重金属含量低，硅羟基活性小，拖尾减小是色谱柱质量好坏的重要标志,对色谱柱填料的了解(六),填料的pH稳定性硅胶填料 pH：2-8聚合物填料 pH：2-12杂化硅胶填料 pH：2-12pH值小于2时键合相水解pH值大于8时硅胶溶解,硅胶表面键合相的水解（PH2）,+HCl,+,+,Low pH(hydrolysis of ligand),Note:Someti
10、mes called“Column Bleed”,硅胶的溶解（PH8）,Complete dissolution of Silica Catastrophic column failure Short lifetimes,Nucleophilic attack,Waters专利的柱填料颗粒,优点,缺点,无机基质(C18 硅胶),机械强度高 柱效高 保留稳定,有限的pH应用范围 对碱性分析物拖尾 化学不稳定性,有机基质(高聚物),很宽的pH应用范围 无离子型作用 化学稳定性好,机械强度不佳 柱效低 保留行为难以预测,杂化颗粒技术(具硅-碳键机制),四乙氧基硅烷(TEOS),硅甲基嵌入型聚乙氧基硅
11、烷(MPEOS),甲基三乙氧基硅烷(MTEOS),Waters 专利技术荣获2000年全球 R&D 100 大奖,第一代杂化颗粒的合成过程,为何杂化颗粒柱可增加在高pH下的柱寿命？,硅胶快速溶解 严重的柱失效 柱寿命短暂,Surface modified Silica Particles,因嵌入硅甲基的阻挡,颗粒表面溶解速度明显减缓 柱寿命大大延长,XTerra Hybrid Particles,普通硅胶柱,基于杂化颗粒的Xterra 柱,XBridge:第二代杂化填料的合成,硅胶基体中插入的桥式乙基,Anal.Chem.2003,75,6781-6788,美国专利号 6,686,035 B2
12、,挑战性流动相:0.02N NaOH pH 12.3,50C测试时的流动相:50/50(v/v)乙腈/水,50C标准测试物:苯癸酮,要使柱效降低一半,需将色谱柱曝露在0.02N NaOH(pH 12.3)和 50下的小时数,将高pH 柱稳定性推向新极限,磷酸拥有三个 pKa:pK1=2.15,pK2=7.2,pK3=12.3磷酸缓冲盐系统具有超低的紫外吸收,对从事非LC/MS分析的科学家具有很大吸引力持续有科学家寻求在以上三个pH范围均可稳定使用的分离柱“如果你能提供具有以上能力的色谱柱,我肯定会购买它!”从许多色谱学者得到的反馈X-Bridge 系列柱是目前唯一提供这一可能的色谱柱!,将高p
13、H 柱稳定性推向新极限,能否使用高 pH磷酸缓冲系统(pH 12)?,对色谱柱填料的了解(七),填料的热稳定性普通硅胶填料柱温:60聚合物填料(高温GPC)柱温:150杂化硅胶填料(XTerra,XBridge)柱温:90,液相色谱柱的分类,从柱子类型上分：分配/吸附，离子交换，凝胶，亲合从柱体积及柱结构上分：内径：2.1mm以下(微径柱)、2.1mm 7.8mm(分析柱)、7.9mm 50mm（制备柱）长度：5cm 60cm从柱体材料上分不锈钢（普通/可换柱芯）玻璃聚合物（径向加压）、PEEK,Waters主流色谱柱应用特色,第二代杂化颗粒技术Waters专利！宽pH范围、耐受性最强、通用性
14、最佳的色谱柱硅胶基质色谱柱，低键合相比例，专利封端增强极性化合物保留、减弱强疏水性保硅胶基质色谱柱，高纯基质、高比表面积高容量、峰形柱效最优化、中-低pH条件下通用CSH表面带电杂化颗粒技术及HSS高强度硅胶颗粒XSelect CSH C18:宽选择性覆盖、特别有利于LCMS兼容性高/低pH方法开发,内容,色谱柱应用基础HPLC色谱柱介绍色谱柱使用保养知识,XBridge：基于第二代杂化颗粒技术BEH(Bridged Ethylene Hybrid),Anal.Chem.2003,75,6781-6788,U.S.Patent No.6,686,035 B2,硅氧骨架中嵌入亚乙基桥,-pH范围
15、耐受更宽机械强度更高柱效佳,LC系统:ACQUITY UPLCTM H-Class system色谱柱:ACQUITY UPLCTM BEH C18 1.7 m2.150mm;P/N:1860023502010药典人参含量测定，通过将HPLC方法转换成UPLC方法，分析时间由120min缩短到10min,2010药典人参含量测定,键合相提供不同选择性,方法开发中全能型色谱柱!,特殊键合相满足特定需求Shield RP18：内嵌极性基团C18,通过极性嵌入基团保留水 可完全兼容100%水相 屏蔽硅醇基，对碱性化合物峰形更佳 提供与C18不同的选择性,Shield RP技术改善碱性峰形实例（XBr
16、idge RP18有更宽pH范围，pH 2-11！）,pH 7.0,注：所示色谱柱性能比较情况，与具体操作条件相关，可能不能代表所有应用情况（法律申明）,阿奇霉素各国药典方法,XBridge Shield RP18最适于阿奇霉素分析,国家食品药品监督管理局关于修订阿奇霉素氯化钠注射液和阿奇霉素葡萄糖注射液药品标准有关事宜的公告,照高效液相色谱法（中国药典2005年版二部附录V D）测定，采用硅胶表面经杂化处理的十八烷基键合硅胶色谱柱如XBridgeTMShield RP18（规格：2504.6mm，5um）或与之相当的色谱柱，柱温30；以乙腈-磷酸盐缓冲液（取0.05mol/L磷酸氢二钾溶液，
17、用20%磷酸调节pH值至8.2）（58：42）为流动相；流速为每分钟1.0ml；检测波长为210nm。,Hilic 模式色谱柱:XBridge Amide&XBridge Hilic,键合类型:三键键合酰胺键颗粒大小:1.7,2.5,3.5 m 键合密度:7.5 mol/m2碳含量:12%封端:无pH 范围:2-11,键合类型:无键合相颗粒度:1.7,2.5,3.5,5 m 键合密度:碳含量:封端:pH 范围:1-9,XBridgeTM HILIC与反相提供互补的分离选择性,Minutes,0.00,1.00,2.00,3.00,4.00,5.00,6.00,1,2,3,3,2,1,V0=0.
18、26,V0=0.25,Reversed-PhaseXBridge C18,HILICXBridge HILIC,3.Morphine 3-D-Glucuronide,2.morphine,1.6-acetyl morphine,HILIC 可以提供和反相不同的分离选择性,Hilic 方法开发策略,如需了解更多，请联系Waters消耗品部应用工程师,应对越来越多的生物医药项目,应用于生物医药行业的：肽的反相分析与分离纯化 小蛋白药物的反相分析 寡核苷酸的离子对反相分析与分离纯化杂化颗粒，无以伦比的流动相pH与温度的耐受性完整的方法与应用资料，整体方案专用柱，经肽谱、蛋白混标或寡核苷酸阶梯混标质控
19、确保批次重现性,极性化合物保留专用柱:Atlantis/HSS T3,在增强极性化合物保留能力的同时，维持了对中等和强疏水化合物的适度保留能力LC-MS兼容耐受100%水相流动相分离重现性好T3是采用三官能团键合技术，低配基密度(1.6 mol/m2)C18 烷基链键合和专利的封端技术,是Waters公司最先进的键合和封端技术的有力体现;T3对 dC18色谱柱的稳定性进行了更好的提升,切实增强对极性化合物的保留,1.Thiourea2.5-Fluorocytosine(B)3.Adenine(B)4.Guanosine-5-monophosphate5.Thymine,注：所示色谱柱性能比较情
20、况，与具体操作条件相关，并不代表所有应用情况（法律申明）,HSS T3分析OTC感冒药活性成分,2010药典复方丹参滴丸,应对高容量和峰形柱效的需求,色谱工作者的需求和问题：柱效？！柱容量？！载样量高？！中-低pH条件下碱性化合物拖尾严重？！样品杂质或相关物质分析及分离？！,4,8,12,对碱性化合物峰形更佳的更优质硅胶色谱柱,5,1,Vo,2,3,4,Symmetry C18 5 mUSP Tf=1.69N=6961,以Amitriptyline（峰5）计算拖尾因子USP Tf pH7条件下,SunFire C18 5 mUSP Tf=1.26N=8203,CSH表面带电杂化颗粒技术的键合相
21、产品,CSH C18三点键合 C18广泛的pH使用范围 pH 1-11卓越的峰形与柱效，无论是典型缓冲盐流动相体系还是低离子强度流动相体系130A CSH C18多肽和小分子蛋白，0.1%FA具有卓越的上样量CSH Phenyl-Hexyl（苯己基，USP L11)三点键合 C6-Phenyl广泛的pH使用范围 pH 1-11对于芳香性分析物提供互补的选择性CSH Fluoro-Phenyl（氟苯基，USP L43）三点键合的、未经封端的、五氟苯基 pH 1 8与烷基柱相比具有独特的选择性稳定的、重现的生产控制,对碱性分析物有卓越的峰形与载量尤其适合LCMS流动相条件,丙咪嗪浓度保持恒定为 0
22、.5 mg/mL;使用利于LCMS分析的0.1%甲酸流动相条件,2.0%,1.0%,0.5%,0.1%,丙咪嗪,2.0%,1.0%,0.5%,0.1%,Amitriptyline,ACQUITY CSH C18 1.7 m0.1%formic acid,Superficially Porous C18 1.7 m 0.1%formic acid,观察CSH技术对碱性物质有卓越的峰形，特别是使用兼容LCMS检测的流动相条件时。特别有利于对低含量物质的检测，有好的峰形、分离度与灵敏度。,丙咪嗪,阿米替林,阿米替林,覆盖全部现代反相色谱柱的选择性范围BEH+CSH+HSS:,ACQUITY BEH
23、PhenylXBridge Phenyl,ACQUITY BEH C18XBridge C18,ACQUITY BEH Shield RP18XBridge Shield RP18,ACQUITY BEH C8XBridge C8,ACQUITY HSS C18 SBXSelect HSS C18 SB,ACQUITY HSS C18XSelect HSS C18,ACQUITY HSS T3XSelect HSS T3,ACQUITY CSH C18XSelect CSH C18,ACQUITY CSH Phenyl-HexylXSelect CSH Phenyl-Hexyl,ACQUITY
24、 CSH Fluoro-PhenylXselect CSH Fluoro-Phenyl,ACQUITY HSS CNXSelect HSS CN,ACQUITY HSS PFPXSelect HSS PFP,内容,色谱柱应用基础HPLC色谱柱介绍色谱柱使用保养知识,色谱柱的连接,各种锥箍和管路接头长度示意图:,色谱柱的连接,Stop_depth长度不合适造成柱前死体积柱外扩散,造成色谱峰展宽,死体积,正常,峰扩散,色谱柱的连接,锥箍锥度不合适造成渗漏,测柱效-良好的色谱实验习惯,拿到一根新色谱柱时，先测柱效保留在新色谱柱上测得的色谱图，并记录色谱测试条件定期检测柱效定期检测仪器的谱带展宽,测柱
25、效的方法,色谱柱种类繁多,性能各异,测定方法亦各不相同Waters的色谱柱均附有Use and Care说明书,可按说明书所述方法测定如若柱盒中无纸质说明书，请到以下网址获取以下是Waters反相C18柱的测定方法:流动相:乙腈/水=60:40;流速:1ml/min样品:50mg Acenaphthene(二氢苊)溶于100ml乙腈,加入600l丙酮进样量13l检测波长:254nm,计算色谱柱的柱效 N,理论塔板数计算公式：Ws 方法Wtan16切线法Wh5.54半峰高W3s9 3sW4s16 4sW5s25 5s,Inject,Inject,用“切线”法计算柱效,不好的色谱柱的柱效反而比好色
26、谱柱的要高，因为其拖尾部分测不出来,好柱,坏柱,好柱,Inject,Inject,用“5”法计算柱效,坏柱,测量色谱系统的谱带展宽,卸下色谱柱，用UNION(两通)代替之按测柱效方法，以1/10的样品浓度进样，大约25微升用5 sigma方法测4.4%峰高处的峰宽：W仪器参数流速1.0 ml/min检测器时间常数小于0.2谱带展宽（ml）=1000W（min）,色谱柱的正确使用及操作,流动相的转换特别是GPC柱流速(压力)的变化幅度温度的变化幅度专用色谱柱样品及溶剂的要求,正确使用色谱柱(一),样品方面除去微粒及杂质了解样品在流动相中的溶解度如溶样品的溶剂不是流动相，一定要用流动相试溶解度，防
27、止其在流动相中析出 了解样品与色谱柱的基质/填料是否有相互作用,正确使用色谱柱（二）,流动相方面除去微粒纯度的要求超纯水，梯度实验时水中有机杂质含量要低缓冲液的pH值，在填料的允许范围内缓冲液（盐）的浓度有机溶剂：色谱纯,杂质含量尽量低,并与填料相匹配流动相对样品的溶解度有机溶剂或水的比例,色谱柱的在线保护装置,给色谱柱提供物理的保护除去样品及流动相中的颗粒给色谱柱提供化学的保护防止分析柱被化学污染装置在线过滤器Sentry Guard 保护柱,在线过滤器,In-Line Filter，部件号 WAT084560防止颗粒在色谱柱头累积优点：基本不影响柱效在需要高柱效的分析时常用(如：氨基酸分析
28、)可更换的消耗品更换滤芯，部件号 WAT088084(1/pkg)更换滤芯，部件号 WAT005139(5/pkg),保护柱,可避免化学污染多数保护柱影响到整个色谱柱的柱效，特别是在用微柱时选保护柱的原则与所用色谱柱品牌、内径一致Sentry Guard保护柱通用保护柱卡套部件号:WAT046910(适用于3.0,3.9,4.620mm保护柱)186000262(适用于2.120mm保护柱)WAT097958(适用于2.110mm保护柱),色谱柱的清洗,对所做的样品要有充分的了解用对该样品洗脱能力最强的流动相清洗硅胶柱的一般方法先用甲醇洗去极性杂质用干燥的二氯甲烷、正庚烷100200ml依次活化键合相柱(烷基)的一般方法20倍柱体积的：甲醇-氯仿-甲醇-水依次冲洗,色谱柱的清洗,一些供参考的反相色谱柱清洗程序:,色谱柱的存放,存放前的处理除去杂质、缓冲盐合适的存放溶剂避免色谱柱床的干涸避免机械震动防止细菌生长注意存放的温度,问题?,
