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1、测序原理和流程,引物和PCR传统测序法Sanger法新一代测序法solexa,引物和PCR,什么是引物一小段单链DNA，用来引发PCR反应什么是PCRPolymerase Chain Reaction 聚合酶链式反应，是复制DNA的反应。做PCR的目的是什么扩增。由DNA链上的已知片段向特定的区域延伸，从而得到特定区域的DNA。,再复性,P1,P1,P2,P2,再延伸,第二轮扩增结束,P1,P1,P1,P1,P2,P2,P2,P2,第三轮扩增结束,通过不断扩增延伸，长片段线性增长，而目标片段指数增长，最终反应主产物是目标片段,PCR扩增NGF基因（大鼠）,rat beta-nerve grow
2、th factor sequence5-301 gttctacact ctgatcacag cgtttttgat cggcgtacag gcagaaccgt acacagagat361 caatgtccca gagggagact ctgtccctga agaccactgg actaaacttc agcattccct421 ctgacacagc cctacgcaga gcccgcagtg cccctgctga accaatagct gcccgtgtga481 agggacgacc cgcaacatca ctgtggaccc caaactgttt aagaaacgga gactccgttc541
3、accccgcgtg ctgtttagca cccagcctcc caaactgttt aagaaacgga gactccgttc-3Primer 1:(5)gat cgg cgt aca ggc aga ac(3)328-347Primer 2:(3)cgc ggg gtg aac gga gtc tc(5)529-548 预期扩增长度：220bp,DNA Marker,NGF,2000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,100bp,220bp,通过胶图验证PCR是否成功,PCR的特点和用途灵敏度高、特异性强1、获取DNA2、验证,引物设计的基本原则有效：能结合到模板上引
4、物自身没有消耗唯一：一定范围内不错配,引物的自身消耗发夹结构：5-ACATGAGGTACCAGCCCCATGT-3 5-ACATGAGGTAC|3-TGTACCCCGAC引物二聚体结构：引物1：TACCGAACTCAGGGAACAGC|引物2：GACTCCATTGCCTAGCCTGG,引物设计的通常条件1、引物长度。1530bp，通常设计引物都在1827之间的范围内。太短则特异性降低容易引起错配，太长则结合能量过高，不易结合。2、引物的3端比5端重要，5端如果有个别碱基错配仍可结合，3端如果有错配则不可结合。3端尽量不要出现连续相同碱基。3、GC含量。通常在40%60%之间容易进行PCR反应，
5、过高或者过低都会增加反应难度。PCR的上下游引物GC含量不能相差太大。4、PCR的Tm值（退火温度）一般在5570 之间。（不同软件的计算差异很大，有时需要摸索条件）5、引物中尽量避免发夹结构和引物二聚体的出现。,Sanger测序法,Sanger测序技术的发展70年代末，Walter Gilbert发明化学法 Frederick Sanger发明双脱氧链终止法手动测序，同位素标记80年代中期，出现自动测序仪（应用双脱氧链终止法原理）荧光代替同位素，计算机图象识别90年代中期，测序仪重大改进集束化的毛细管电泳代替凝胶电泳2001年完成人类基因组框架图,链终止法的原理：以单条DNA链为模板合成互补
6、链。在合成原料（2脱氧核苷酸）中掺入标记过的23双脱氧核苷酸。合成互补链的反应会随机终止。而得到大量终止处带有标记的DNA片段。通过电泳分离这些片段来读出序列。,脱氧核苷酸和双脱氧核苷酸,链终止法的核心仍然是PCR通过反应的随机终止，使读取序列成为可能,峰图文件,PHD文件,BEGIN_COMMENTABI_THUMBPRINT:0CALL_METHOD:phredQUALITY_LEVELS:99TIME:Mon Aug 9 15:08:48 2004TRACE_ARRAY_MIN_INDEX:0TRACE_ARRAY_MAX_INDEX:5301TRIM:0 648-1.00CHEM:un
7、knownDYE:unknownEND_COMMENTBEGIN_DNAa 27 45c 27 53a 34 60t 34 66a 33 74END_DNAEND_SEQUENCE,Sequence file(Fasta),rax_539101.y1.abd CHROMAT_FILE:rax_539101.y1.abd PHD_FILE:rax_539101.y1.abd.phd.1 CHEM:term DYE:ET TIME:Mon Oct 30 15:10:42 2000CCCCCCCCTCAAGTAAAATACTATCTCGGAACGACATAACGTTTTAGATTCGTCATAGTC
8、TTTCCTGTACAACTCATTGAGCCTCACGCCGTTGTCCATTTGCTGTTTGCCATTTAGTCGTACGTCGGTGGGACAGGGGAGTCGGATGTATAGCAGGTTCTTTACAATATTGCAGCACCATGGGTTCGCCAGAGAGTTGTGGGTCTTCTATTGATCATAGATATCTAGCGATGCCTAAGTGCATGGTTTATCTTCTGAGAATATATTCTTTCATAGTGAGGGGTCATTCACCGTAATTAGTTCTGGACTCTTTTGGAGAATTATTAAATTATTTGATGACCTTGAAATATTTTGCCATTA
9、TTCAATGTGCTCATAATAATATTAAGATTTATGTCTACCATGCTTGAATAATTGATATTAACATCATAAGATTTTAAATAAGATTTATATTTTTAGATACACCTTAGAAACACTTCCATAATATATCATTTCGCTAACTT,Quality file(Fasta),203c04_0102.g1.abi 682 17 430 ABI21 21 29 26 26 26 32 33 47 48 48 51 51 51 46 42 4232 33 47 48 48 51 51 51 46 42 35 34 34 34 34 34 42 42 42
10、 56 56 56 56 48 48 44 44 42 42 42 42 42 42 35 31 31 31 31 35 42 48 56 51 51 42 42 42 42 40 45 37 37 40 36 45 35 35 35 32 45 45 42 42 37 37 37 37 44 44 56 56 42 42 36 35 35 35 35 35 37 37 37 40 51 51 51 51 56 56 56 56 56 56 42 44 46 43 42 40 40 45 45 35 35 35 29 29 17 29 31 40 39 45 40 42 40 42 37 35
11、 35 35 35 37 42 42 44 46 43 43 43 42 42 42 42 42 42 42 37 42 44 44 56 37 37 37 37 37 37 46 51 44 43 42 42 35 36 30 33 33 38 38 36 36 36 36 42 42 44 37 37 37 37 37 31 29 29 29 24 24 28 28 28 36 42 44 42 42 42 35 29 29 29 29 29 29 42 29 35 29 25 25 32 27 25 16 17 17 24 24 29 29 23 29 33 40 40 40 40 25
12、 25,目前华大的Sanger测序仪有以下两种：Megabace96孔板，读长500bps，scf格式峰图3730/3700384孔板，读长700bps以上，ab1格式,质量的控制,用质量值Q来判断结果的可靠性Q=-10*logX(X是单碱基错误率)Trim掉低质量序列，使用高质量序列,一些问题,为什么GC过高或过低的DNA会造成测序困难？高质量的测序结果一定可信吗？引物在测序模板上的结合位置不唯一会导致什么后果？测序模板本身不唯一会导致什么后果？,新兴的测序方法solexa,Solexa测序方法是由solexa公司（目前已被illumina兼并）开发的低成本高通量的测序方法。于2006年发布
13、。目前solexa测序的主要用途是重测序和表达分析，全基因组测序组装尚处在试验过程。,反应单位：cluster,A C,T G,Cycle N,Solexa的优缺点,优点通量大，成本低（sanger法的1/100）shotgun测序的覆盖度和随机性相对较好缺点目前技术尚不成熟读长太短，拼接难度大,Solexa数据,读长：3575bps时间：3days/SE36run通量：1G/run质量：理想情况下接近Q40标准GC敏感度：相对低,为什么说solexa是“下一代”测序技术,反应模板的承载方式的改变从孔到簇从游离态到固态反应控制方式的改变从个体控制转为进程控制最终结果是通量的飞跃从点到面,测序的发展方向,质量,读长,通量,成本,
