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2、光定量PCR介绍,6,July 29,2023,Real Time PCR扩增过程中，每个反应管内的荧光信号值达到设定的阈值时所经历的循环数。(C-代表Cycle，t-代表threshold）,Ct值概念,阈值：在扩增曲线的指数增长区域内适当位置上设定的荧光检出界限。,Real Time PCR中的概念,实时荧光定量PCR介绍,7,July 29,2023,在PCR反应体系中加入荧光物质，并实时监测荧光信号积累的整个PCR进程，最后通过已知浓度的标准品制作的标准曲线对未知浓度的样品进行定量分析。,Real Time PCR的原理,实时荧光定量PCR介绍,8,July 29,2023,Real
3、Time PCR检测系统-简介,实时荧光定量PCR介绍,July 29,2023,LightCycler 480,Rotor-gene6000,MiniOpticon,Mx3005PTM,LINE-GENE FQD-66A,ABI PRISM 7500,iQ5 Real-Time PCR Detection System,TaKaRa TP800,实时荧光定量PCR介绍,July 29,2023,各公司Real Time PCR检测系统比较,实时荧光定量PCR介绍,July 29,2023,Real Time PCR基础知识,实时荧光定量PCR介绍,12,July 29,2023,TaqMan
4、Probe,CyclingProbe,MolecularBeacon,etc.,SYBR Green I,荧光染料嵌合法,荧光探针法,Real Time PCR的检测方法,实时荧光定量PCR介绍,13,July 29,2023,荧光染料嵌合法（SYBR Green I）,SYBR Green I：是一种能结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的 具有绿色激发波长的染料。,SYBR Green I,实时荧光定量PCR介绍,14,July 29,2023,F,SYBR Green I 法作用机理示意图,实时荧光定量PCR介绍,15,July 29,2023,TaqMan法作用机理,TaqMan探针为一
5、寡核苷酸，5 端标记一个报告基团（Reporter），3 端标记一个淬灭基团（Quencher）。,Q,实时荧光定量PCR介绍,16,July 29,2023,TaqMan Probe法原理示意图,实时荧光定量PCR介绍,17,July 29,2023,CycleavePCR法原理,Cycling probe为一寡核苷酸，一端标记一个荧光报告基团（Reporter），一端标记一个荧光淬灭基团（Quencher），寡核苷酸为DNA/RNA杂合体。,RNase H,实时荧光定量PCR介绍,18,July 29,2023,CycleavePCR法原理示意图,实时荧光定量PCR介绍,19,July 2
6、9,2023,SYBR Green I 法与Probe法比较,常用于mRNA表达量分析等,SYBR Green I 法,简便易行,价格便宜,要求反应的特异性,不能进行多重PCR,常用于SNP解析，病毒、病源菌检测,实时荧光定量PCR介绍,20,July 29,2023,主 要 内 容,实时荧光定量PCR介绍,21,July 29,2023,One Step和Two Step RT-PCR的选择,实时荧光定量PCR介绍,22,July 29,2023,Two-Step RT-PCR,One-Step RT-PCR,One-Step RT-PCR,One Step和Two Step RT-PCR的
7、选择,实时荧光定量PCR介绍,23,July 29,2023,RT Primer的选择,Random Primer Oligo dT Primer Gene Specific Primer,Random 6mer Primer,Gene Specific Primer,Oligo dT Primer,PCR R-Primer,PCR F-Primer,实时荧光定量PCR介绍,24,July 29,2023,RT Primer的选择,实时荧光定量PCR介绍,25,July 29,2023,Total RNA中Genomic DNA混入的对策,PCR Primer,exon,intron,exon
8、,Genomic DNA,cDNA,exon,exon,PCR Primer,Real Time PCR,Real Time RT-PCR,Small PCR Product,Small PCR Product,此种情况必须采用DNase I 处理，去除基因组DNA。,融解曲线分析,实时荧光定量PCR介绍,26,July 29,2023,PCR Primer,exon,intron,exon,Genomic DNA,cDNA,exon,exon,PCR Primer,Real Time PCR,Real Time RT-PCR,Long PCR Product or No Product,Sm
9、all PCR Product,融解曲线分析,可以区分cDNA或者基因组DNA来源的扩增产物。,Total RNA中Genomic DNA混入的对策,实时荧光定量PCR介绍,27,July 29,2023,PCR Primer,exon,intron,exon,Genomic DNA,cDNA,exon,exon,PCR Primer,Real Time PCR,Real Time RT-PCR,No Product,Small PCR Product,融解曲线分析,Total RNA中Genomic DNA混入的对策,实时荧光定量PCR介绍,28,July 29,2023,Real Time
10、 PCR引物设计,目的是获得目的基因，对非特异性反应和引物二聚体要求不严格。,目的是让目的基因按照理论值进行扩增，对非特异性反应和引物二聚体要求严格。,Real Time PCR用引物与普通PCR引物设计要求不同,=对引物设计要求严格,普通PCR引物,Real Time PCR引物,实时荧光定量PCR介绍,29,July 29,2023,Real Time PCR引物设计原则,实时荧光定量PCR介绍,30,July 29,2023,RefSeq序列,好的引物需要寻找好的参照序列,Real Time PCR引物设计,通过NCBI获得参考序列和相关情报。RefSeq数据库提供无重复，准确性，完整性
11、的基因参考序列。序列可信度高，信息量大,实时荧光定量PCR介绍,31,July 29,2023,LOCUS NM_008777 1959 bp mRNA linear ROD 15-APR-2005DEFINITION Mus musculus phenylalanine hydroxylase(Pah),mRNA.ACCESSION NM_008777VERSION NM_008777.1 GI:6679202SOURCE Mus musculus(house mouse)ORGANISM Mus musculusFEATURES Location/Qualifiersgene 1.1959
12、/gene=Pah/db_xref=GeneID:18478/db_xref=MGI:97473 CDS 48.1409/gene=Pah/note=go_function:iron ion binding goid 0005506/protein_id=NP_032803.1/db_xref=GI:6679203/db_xref=GeneID:18478/db_xref=MGI:97473ORIGIN 1 aattcaaccc tgtgctaagc tagacacctc acttactgag agccagcatg gcagctgttg 61 tcctggagaa cggagtcctg agc
13、agaaaac tctcagactt tgggcaggaa acaagttaca 121 tcgaagacaa ctccaatcaa aatggtgctg tatctctgat attctcactc aaagaggaag 181 ttggtgccct ggccaaggtc ctgcgcttat ttgaggagaa tgagatcaac ctgacacaca 241 ttgaatccag accttcccgt ttaaacaaag atgagtatga gtttttcacc tatctggata 301 agcgtagcaa gcccgtcctg ggcagcatca tcaagagcct g
14、aggaacgac attggtgcca 361 ctgtccatga gctttcccga gacaaggaaa agaacacagt gccctggttc ccaaggacca 421 ttcaggagct ggacagattc gccaatcaga ttctcagcta tggagccgaa ctggatgcag 481 accacccagg ctttaaagat cctgtgtacc gggcgagacg aaagcagttt gctgacattg 541 cctacaacta ccgccatggg cagcccattc ctcgggtgga atacacagag gaggagagga
15、 601 agacctgggg aacggtgttc aggactctga aggccttgta taaaacacat gcctgctacg 661 agcacaacca catcttccct cttctggaaa agtactgcgg tttccgtgaa gacaacatcc 721 cgcagctgga agatgtttct cagtttctgc agacttgtac tggtttccgc ctccgtcctg 781 ttgctggctt actgtcgtct cgagatttct tgggtggcct ggccttccga gtcttccact 841 gcacacagta catt
16、aggcat ggatctaagc ccatgtacac acctgaacct gatatctgtc 901 atgaactctt gggacatgtg cccttgtttt cagatagaag ctttgcccag ttttctcagg 961 aaattgggct tgcatcgctg ggggcacctg atgagtacat tgagaaactg gccacaattt 1021 actggtttac tgtggagttt gggctttgca aggaaggaga ttctataaag gcatatggtg 1081 ctgggctctt gtcatccttt ggagaattac
17、agtactgttt atcagacaag ccaaagctcc 1141 tgcccctgga gctagagaag acagcctgcc aggagtatac tgtcacagag ttccgacctc 1201 tgtactatgt ggccgagagt ttcaatgatg ccaaggagaa agtgaggact tttgctgcca 1261 caatcccccg gcccttctcc gttcgctatg acccctacac tcaaagggtt gaggtcctgg 1321 ataatactca gcagttgaag aatttagctg actccattaa tagtg
18、aggtt ggaatccttt 1381 gccatgccct gcagaaaata aagtcatgaa cagaaagtga cgtcatagac agaacttagg 1441 aggtcaacca aaaaaatctg ctgatagaag tatagtaact gcttcttttc cctgaagaag 1501 aaaagtttta tttgcaatgt cagcttttaa tatattttcc taacatagtg gaggatcacc 1561 aaataaatca atttctctga atgaaagtat attaaaaccc atcagtggta gatccttcag
19、 1621 agtcacattt gatttagata tctcagacct tcaatttggt ttaaaatgta atttctcagt,GenBank file,NM_008777,Mus musculus phenylalanine hydroxylase(Pah),mRNA.,Real Time PCR引物设计,实时荧光定量PCR介绍,32,July 29,2023,1 aattcaaccc tgtgctaagc tagacacctc acttactgag agccagcatg gcagctgttg 61 tcctggagaa cggagtcctg agcagaaaac tctca
20、gactt tgggcaggaa acaagttaca 121 tcgaagacaa ctccaatcaa aatggtgctg tatctctgat attctcactc aaagaggaag 181 ttggtgccct ggccaaggtc ctgcgcttat ttgaggagaa tgagatcaac ctgacacaca 241 ttgaatccag accttcccgt ttaaacaaag atgagtatga gtttttcacc tatctggata 301 agcgtagcaa gcccgtcctg ggcagcatca tcaagagcct gaggaacgac att
21、ggtgcca 361 ctgtccatga gctttcccga gacaaggaaa agaacacagt gccctggttc ccaaggacca 421 ttcaggagct ggacagattc gccaatcaga ttctcagcta tggagccgaa ctggatgcag 481 accacccagg ctttaaagat cctgtgtacc gggcgagacg aaagcagttt gctgacattg 541 cctacaacta ccgccatggg cagcccattc ctcgggtgga atacacagag gaggagagga 601 agacctgg
22、gg aacggtgttc aggactctga aggccttgta taaaacacat gcctgctacg 661 agcacaacca catcttccct cttctggaaa agtactgcgg tttccgtgaa gacaacatcc 721 cgcagctgga agatgtttct cagtttctgc agacttgtac tggtttccgc ctccgtcctg 781 ttgctggctt actgtcgtct cgagatttct tgggtggcct ggccttccga gtcttccact 841 gcacacagta cattaggcat ggatct
23、aagc ccatgtacac acctgaacct gatatctgtc 901 atgaactctt gggacatgtg cccttgtttt cagatagaag ctttgcccag ttttctcagg 961 aaattgggct tgcatcgctg ggggcacctg atgagtacat tgagaaactg gccacaattt 1021 actggtttac tgtggagttt gggctttgca aggaaggaga ttctataaag gcatatggtg 1081 ctgggctctt gtcatccttt ggagaattac agtactgttt at
24、cagacaag ccaaagctcc 1141 tgcccctgga gctagagaag acagcctgcc aggagtatac tgtcacagag ttccgacctc 1201 tgtactatgt ggccgagagt ttcaatgatg ccaaggagaa agtgaggact tttgctgcca 1261 caatcccccg gcccttctcc gttcgctatg acccctacac tcaaagggtt gaggtcctgg 1321 ataatactca gcagttgaag aatttagctg actccattaa tagtgaggtt ggaatcc
25、ttt 1381 gccatgccct gcagaaaata aagtcatgaa cagaaagtga cgtcatagac agaacttagg 1441 aggtcaacca aaaaaatctg ctgatagaag tatagtaact gcttcttttc cctgaagaag 1501 aaaagtttta tttgcaatgt cagcttttaa tatattttcc taacatagtg gaggatcacc 1561 aaataaatca atttctctga atgaaagtat attaaaaccc atcagtggta gatccttcag 1621 agtcaca
26、ttt gatttagata tctcagacct tcaatttggt ttaaaatgta atttctcagt 1681 tctcatcaac attcatcaaa tttgggactc atatcatttg ggctctgtct gttcattttt,CCTGGCCAAGGTCCTGCG,TTGGAACCAGGGCACTGTGT,AAAGCAGTTTGCTGACATTGCCTAC,TTCAGAGTCCTGAACACCGTTCC,ACTCTTGGGACATGTGCCCTTG,TCTTCTCTAGCTCCAGGGGC,AAAGTCATGAACAGAAAGTGA,GTGATCCTCCACTA
27、TGTTAG,Forward,Reverse,Real Time PCR引物设计,实时荧光定量PCR介绍,33,July 29,2023,CCTGGCCAAGGTCCTGCG,TTGGAACCAGGGCACTGTGT,AAAGCAGTTTGCTGACATTGCCTAC,TTCAGAGTCCTGAACACCGTTCC,ACTCTTGGGACATGTGCCCTTG,TCTTCTCTAGCTCCAGGGGC,AAAGTCATGAACAGAAAGTGA,GTGATCCTCCACTATGTTAG,Forward,Reverse,5-,5-,5-,5-,5-,5-,5-,5-,-3,-3,-3,-3,SN
28、P,3 末端的T,3bp互补,Real Time PCR引物设计,实时荧光定量PCR介绍,34,July 29,2023,Real Time PCR引物设计,31,实时荧光定量PCR介绍,35,July 29,2023,Real Time PCR用TaqMan探针设计原则,Real Time PCR探针设计原则,实时荧光定量PCR介绍,36,July 29,2023,探针荧光标记物的选择,实时荧光定量PCR介绍,37,July 29,2023,线性关系、扩增效率确认,检测灵敏度确认,PCR扩增效率（E）：,35Cycles内可得到好的定量结果。如果采用SYBR检测方法，30Cycles内无非特
29、异性产物扩增。,相关系数（r2）：大于0.98,反应性能确认,实时荧光定量PCR介绍,38,July 29,2023,标准Protocol95 5 sec.60 30 sec.,B.有非特异性扩增时 提高退火、延伸温度 缩短退火、延伸时间 降低引物浓度,PCR条件优化顺序,实时荧光定量PCR介绍,39,July 29,2023,主 要 内 容,实时荧光定量PCR介绍,40,July 29,2023,标准曲线制作,扩增曲线,标准曲线,标准品梯度的选择：56个梯度标准品稀释倍数的选择：标准品稀释倍数通常为5-10,105 104 103 102 101 100,105 104 103 102 10
30、1 100,实时荧光定量PCR介绍,41,July 29,2023,标准品的种类,实时荧光定量PCR介绍,42,July 29,2023,质粒标准品的构建,紫色 部分为Real Time引物区,红色 部分为标准品构建用引物区,质粒标准品引物设计,AGTACCTAGATCCTAG,AGTACCTAGATCCTAG,实时荧光定量PCR介绍,43,July 29,2023,质粒标准品构建流程,基因组DNA,PCR,目的基因克隆,目的基因,目的基因,目的基因,质粒,质粒提取，OD值定量。将质粒梯度稀释至105-101 copies/ul，作为标准品。,实时荧光定量PCR介绍,44,July 29,20
31、23,RNA标准品构建,紫色部分为Real Time引物区,红色部分为标准品构建用引物区,蓝色部分T7启动子和Poly(T),实时荧光定量PCR介绍,45,July 29,2023,体外转录RNA标准品构建流程,RNA纯化后，测OD定量。将RNA梯度稀释至105-101 copies/ul，作为标准品。,T7 RNA polymerase,体外转录RNA,Total RNA,PCR,cDNA,RT,T7 Promoter,TTTTT,PCR产物,目的基因,目的基因,目的基因,AAAAA,AAAAA,实时荧光定量PCR介绍,46,July 29,2023,理想的标准品扩增曲线,基线平整Negat
32、ive Control为水平线指数区较明显，陡度大平台区汇于一起线性范围宽,实时荧光定量PCR介绍,47,July 29,2023,理想的标准曲线,相关系数（r2）：大于0.98，越接近1，结果可信度越高。扩增效率（E）：，越接近1，越理想。,扩增效率,相关系数,扩增效率（E）计算方法,标准曲线X轴表示起始模板浓度（log10)，Y轴表示Ct值时 E=10-1/a-1 标准曲线X轴表示Ct值，Y轴表示起始模板浓度（log10)E=10-a-1,实时荧光定量PCR介绍,48,July 29,2023,Real Time PCR解析方法,实时荧光定量PCR介绍,49,July 29,2023,融解
33、曲线分析,Tm值是指双链DNA分子解链一半时的温度。,SYBR Green I 法进行检出时，要根据融解曲线确认PCR产物的特异性。,实时荧光定量PCR介绍,50,July 29,2023,特异性产物,非特异产物,引物二聚体,对PCR产物特异性进行分析,融解曲线分析,实时荧光定量PCR介绍,51,July 29,2023,Real Time PCR解析方法,实时荧光定量PCR介绍,52,July 29,2023,绝对定量解析方法,提取样品,引物设计,标准品制备,Real Time PCR反应,数据分析,流程,实时荧光定量PCR介绍,53,July 29,2023,绝对定量解析方法,通过制作标准
34、曲线来确定样品的初始模板拷贝数或浓度。通常应用于病毒、细菌、衣原体、支原体的定量检测及转基因食品的检测。,105,104,103,101,扩增曲线图,标准曲线图,检测样品,检测样品,102,实时荧光定量PCR介绍,54,July 29,2023,相对定量解析方法,以上条件不可能同时得到满足，必须用内对照基因（管家基因）校正，进行相对表达量分析。,进行相对表达量分析必要性,实际上目的基因表达量分析,实时荧光定量PCR介绍,55,July 29,2023,相对定量解析方法,管家基因 维持细胞基本代谢活动所必须的基因,如：GAPDH、-actin等。,筛选方法,根据文献提供 通过具体实验筛选,实时荧
35、光定量PCR介绍,56,July 29,2023,相对定量解析方法,通过标准曲线对对照样品、检测样品的目的基因及管家基因进行定量，然后以管家基因的定量结果为依据对目的基因进行比值校正，求得相对值即为相对表达量。,相对值=,校正值=,目的基因定量结果,管家基因定量结果,检测样品的校正值,对照样品的校正值,通过对照样品、检测样品的目的基因及管家基因的Ct值，然后以管家基因的Ct值为依据对目的基因进行差值校正，最终求得相对表达量。,双标准曲线法,Ct法,相对值=2,-Ct(目检-管检)-Ct(目对-管对),实时荧光定量PCR介绍,57,July 29,2023,主 要 内 容,实时荧光定量PCR介绍
36、,58,July 29,2023,定性分析应用例 对人的ALDH2基因进行SNP解析,实时荧光定量PCR介绍,59,July 29,2023,SNP解析原理示意图,实时荧光定量PCR介绍,60,July 29,2023,Cycling Probe法,PCR-RFLP法,ROX,FAM,ROX、FAM通道均有信号检出,Eco57 ICTGAAG(N)16GACTTC(N)14wild type:切断Mutant type:不切断,ROX,FAM,Mutant,wild,ROX通道有信号检出,FAM 通道检出荧光信号,ROX,FAM,杂合型(hetero),野生型(wild homo),突变型(m
37、utant homo),定性分析应用例 对人的ALDH2基因进行SNP解析,实时荧光定量PCR介绍,61,July 29,2023,定性分析应用例 对人的ALDH2基因进行SNP解析,提取样品,引物、探针设计,Real Time PCR反应,数据分析,流程,实时荧光定量PCR介绍,62,July 29,2023,从人血液中（共计10个样品）提取基因组DNA。,样品提取,提取试剂：Blood Genome DNA Extraction Kit(D9081),定性分析应用例 对人的ALDH2基因进行SNP解析,定量反应,反应试剂：Cycleave PCR Core Kit(DCY501),实时荧光
38、定量PCR介绍,63,July 29,2023,实验结果,Allele 1:突变型,Allele 2:野生型,定性分析应用例 对人的ALDH2基因进行SNP解析,Hetero:杂合型,实时荧光定量PCR介绍,64,July 29,2023,绝对定量应用例 对SARS培养液中所含SARS病毒RNA进行定量,检测方法 TaqMan probe 法 检测样品 3个从SARS病毒培养液中提取的Genomic RNA 目的基因 SARS病毒RNA 内 参 SARS Internal Control RNA 标 准 品 SARS Control RNA 试 剂 One Step PrimeScript R
39、T-PCR Kit（Perfect Real Time）（DRR064）仪 器 Smart Cycler,实时荧光定量PCR介绍,65,July 29,2023,pBluescript II SK(+)Vector,T7 Promoter,SARS Control RNA构建,绝对定量应用例 对SARS培养液中所含SARS病毒RNA进行定量,实时荧光定量PCR介绍,66,July 29,2023,纯化的SARS Control RNA OD值测定结果,体外转录的SARS Control RNA 电泳照片,M1 M2,M1:-Hind digest M2:DL2,000 Marker,DNase
40、 I处理前,DNase I处理后,绝对定量应用例 对SARS培养液中所含SARS病毒RNA进行定量,实时荧光定量PCR介绍,67,July 29,2023,DNA,T7 Promoter,SARS Internal Control RNA的构建,pBluescriptII SK(+)Vector,绝对定量应用例 对SARS培养液中所含SARS病毒RNA进行定量,实时荧光定量PCR介绍,68,July 29,2023,体外转录的Internal Control RNA电泳照片,M1:-Hind digest M2:DL2,000 Marker,纯化的SARS Internal Control R
41、NA OD值测定结果,M1 M2,DNase I处理前,DNase I处理后,绝对定量应用例 对SARS培养液中所含SARS病毒RNA进行定量,实时荧光定量PCR介绍,69,July 29,2023,探针的选择,绝对定量应用例 对SARS培养液中所含SARS病毒RNA进行定量,实时荧光定量PCR介绍,70,July 29,2023,SARS Control RNA 105-101扩增曲线,SARS Genomic RNA Sample 1、扩增曲线,SARS Internal Control RNA扩增曲线,标准曲线,绝对定量应用例 对SARS培养液中所含SARS病毒RNA进行定量,实时荧光定
42、量PCR介绍,71,July 29,2023,定量结果,对三个样品所含SARS病毒RNA进行了准确定量。,绝对定量应用例 对SARS培养液中所含SARS病毒RNA进行定量,实时荧光定量PCR介绍,72,July 29,2023,相对定量应用例 分析小鼠不同组织中PAH基因表达量的变化情况,检测方法 SYBR Green I 荧光嵌合法管家基因 GAPDH基因目的基因 PAH基因标 准 品 cDNA试 剂 PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（DRR047）SYBR Premix Ex TaqTM II(Tli RNase H Plus)（DRR
43、820）仪 器 Thermal Cycler Dice Real Time System（TP800）,实时荧光定量PCR介绍,73,July 29,2023,Total RNA提取,Total RNA基因组DNA去除,标准品RNA制备,标准曲线制作及预实验,详细的实验资料获取,实验设计及引物 设计、合成,样品Real Time PCR反应,相对定量计算及数据分析,数据整理及论文撰写,相对定量应用例 分析小鼠不同组织中PAH基因表达量的变化情况,实时荧光定量PCR介绍,74,July 29,2023,提取Total RNA后电泳照片,提取试剂：TaKaRa RNAiso Plus（D9108）
44、,相对定量应用例 分析小鼠不同组织中PAH基因表达量的变化情况,M C L B M,M：DL2,000 DNA Marker,C：Control RNA,L：Liver RNA,B：Brain RNA,实时荧光定量PCR介绍,75,July 29,2023,目的基因标准曲线制作结果,扩增曲线图,融解曲线图,标准曲线图,管家基因标准曲线制作结果,相对定量应用例 分析小鼠不同组织中PAH基因表达量的变化情况,实时荧光定量PCR介绍,76,July 29,2023,扩增曲线图,样品目的基因定量结果,样品管家基因定量结果,相对定量应用例 分析小鼠不同组织中PAH基因表达量的变化情况,实时荧光定量PCR介绍,77,July 29,2023,通过双标准曲线方法计算得出，苯丙氨酸羟化酶（PAH）基因在小鼠肝脏中的表达量明显高于其在脑组织中的表达水平，二者的表达量比例约为3757：1。,相对定量应用例 分析小鼠不同组织中PAH基因表达量的变化情况,实时荧光定量PCR介绍,78,July 29,2023,Real Time PCR 试剂,实时荧光定量PCR介绍,79,July 29,2023,Real Time RT-PCR 试剂,实时荧光定量PCR介绍,80,July 29,2023,Thank You!,
