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1、第三章 固定化酶反应动力学,酶的固定化外扩散对固定化酶反应动力学的影响内扩散对固定化酶反应动力学的影响扩散影响下的动力学假象,3.1 酶的固定化,背景酶的固定化方法影响固定化酶活力的因素固定化对酶动力学特征的影响,3.1.1 背景,游离酶参与反应的缺点：1）稳定性差、液相中含量少，2）反应结束后不易回收、3）酶、底物和产物处于同一相，对产物分离不利固定化酶：即水不溶性酶，是通过物理的或化学的方法，将溶液酶转变为在一定的空间内其运动受到完全约束，或受到局部约束的一种不溶于水但仍具有催化活性的酶，它能以固相状态作用于底物进行催化反应其优点：可以长期保留在反应器内反复使用，易实现连续化生产；反应结束
2、后易与产物分离，简化了产物分离工艺，其大多数固定化酶稳定性也比游离酶好缺点：活力会下降，反应易受传质速率的控制，对大分子底物、产物不适用研究历史：1916年，Nelson和Griffin发现酵母蔗糖酶能被吸 附到骨碳粉末上，并在吸附状态下具有催化活性；以后以色列科学家对酶的固定化方法、固定化的理化性质等进行了开创性的研究，1969年日本的千叶一郎将固定化氨基酸酰化酶应用于DL氨基酸的拆分上，1971年国际酶工程会议给出了固定化酶的定义。,3.1.2 酶的固定化方法,载体结合法交联法包埋法,物理结合法,离子结合法,共价结合法,凝胶包埋,微胶囊包埋,纤维素包埋,影响固定化酶催化活力的因素,构象效应
3、：由于载体与酶之产的共价键作用，引起酶的活性部位发生扭曲变形，改变了酶活性部位的三维空间结构，减弱了酶与底物的结合力，导致酶的活性下降。位阻效应：由于载体选择不当或载体空隙太小，致使酶的活性部位不易与底物结合，对酶的活性部位造成了空间障碍。分配效应：由于固定化酶载体的亲水性、疏水性及静电作用等，使得底物和产物及其效应物在微环境和宏观环境中浓度不同的现象。扩散效应：底物、产物和效应物的迁移和运转速率受到限制的一种效应。,酶的固定化对其动力学特征的影响,原因：由于酶的活性中心的氨基酸残基的空间结构和电荷状态发生了变化，或者固定化酶的周围形成了能对底物传递产生影响的扩散层或静电的相互作用等。对底物专
4、一性的改变稳定性的改变最适pH值和温度的改变米氏常数的改变,3.2 外扩散的限制作用,特点液固相间的传质速率外扩散的限制作用外扩散有效因子,3.2.1 外扩散的特点,酶促反应过程与传质过程是各自独立的底物先从液相主体扩散到固定化酶的外表面发生反应产物从固定化酶的外表面扩散进入液相主体,3.2.2 液固相间的传质速率,由于搅拌，反应体系中的液相主体的底物浓度处处相同，假定为S0，底物在颗粒表面因反应而消耗，同时由于液体的粘性，在固液表面附近产生一个滞流层，而固体表面液体流速率为0，因而在滞流层产生浓度梯度，进而导致物质的传递，且传质阻力全部集中在滞流层。根据Fick第一定律，得液固相间的传质速率
5、为 其中Ds为底物在液相中的分子扩散系数，m2/s a为固定化酶的比表面积，m-1,S0,Si,R,R+,3.2.3 外扩散的限制作用,固定化酶外表面的反应速率可表示为 当化学反应速率和传质速率相差不大时，体系在稳态条件下，有下式成立，传质速率化学反应速率，即：求解此方程，得出 无因次化处理，令,解之得：，当B0时取+号；当B1（50）时，此时固定化酶反应的控制步骤为传质，此时 Si=0,RSi=KLaS0，反之，当Da1(0.1)，此时固定化酶反应的控制步骤为动力学（化学反应速率），即Si=S0，称为最大本征反应速率。,3.2.4 外扩散有效因子,，根据此定义式知：因此可以根据 判断外扩散的
6、影响。因此在利用固定化酶进行反应时，总是希望 尽可能接近1，此时应控制反应条件，使Da准数尽可能地小，由 知，可以通过降低固定化酶颗粒的粒径，提高液体的流速及适当增加液相主体的底物浓度来使Da减小。,的关系,由图中可以看出：当底物浓度增加而Da不变时，随着底物浓度的增加，增加，即增加底物浓度，可以克服外扩散的影响，当底物浓度不变时，Da增加，减少，且当Da0.1时，接近1。,可观测丹克莱尔准数（）,令，当传质速率和反应速率相差不大时，在稳定状态下有下式成立，因此得到，从此式中可以看出：当 时，外扩散影响可忽略，当 时，外扩散影响明显。怎样识别外扩散的影响？,3.3 内扩散的限制作用,特点液体在
7、微孔内的扩散速率微孔内反应与扩散的关系式内扩散有效因子表观泰勒模数,3.3.1 内扩散的特点,对于多孔的固定化酶颗粒或膜，具有催化作用的部位基本上是在微孔的内表面，因此扩散过程和反应过程是同时发生的。在微孔内，由于内扩散阻力的存在，反应组分在微孔内的浓度分布是不均匀的，对于底物，其浓度在固定化酶外表面处最高，在颗粒或膜中心处最低，形成了由表及里浓度逐渐降低的分布，由于反应和扩散同时进行，所以沿微孔方向，反应速率也在下降，在颗粒中心处，反应速率最低。扩散过程与微孔结构密切相关。,3.3.2 液体在微孔内的扩散,液体在单一圆柱形微孔内的分子扩散速率可用Fick第一定律来表示：其中Ds为底物在液相中
8、的分子扩散系数，一般在1109 m2/s z为沿扩散方向的距离，m Ns为底物在单位时间内通过单位截面积微孔的量，moL/(m2s)但固定化酶颗粒或膜的微孔是非圆柱形的，底物在微孔内的扩散系数要比在液相主体中小得多，工程上采用有效分子扩散系数来表示。扩散中发生在微孔内，且微孔面积与颗粒外表面积之比等于孔隙率微孔的形状是弯曲的，因此引入曲节因子，故在有效分子扩散系数可表示为,3.3.3 微孔内扩散与反应的关系式,球状固定化酶片状固定化,基本假设,模型的建立,颗粒内底物浓度与扩散阻力的关系,3.3.3.1球状固定化酶之基本假设,固定化酶颗粒是等温的颗粒内传质为扩散，且服从Fick第一定律，Des不
9、随位置而变化颗粒是均匀的，不仅其活性分布均匀，性质也均匀底物与产物分配系数为1，固定化酶活性稳定反应为单底物限制，底物与产物的浓度仅沿半径方向变化,球状固定化酶之模型的建立,假定球状固定化酶的半径为R，在距球中心为r处取一壳层，其厚度为dr，底物通过微孔由外向内扩散，且通过此壳层，底物在（r+dr）处扩散进入，在r处离开，并在壳层内发生酶促反应而消耗底物，以扩散方面为正方向，则单位时间内扩散进入微元壳层的底物的量为单位时间内由扩散离开微元壳层的底物的量为：单位时间内微元壳层内的底物的反应量为在稳态条件下，沿扩散方向，底物的物料衡算式可表示为 流入量流出量反应量，即：,r,r+dr,扩散方向,上
10、式可变为，重排后得两边同除以r2dr，得即 上式变为,球状固定化酶之颗粒内底物浓度与阻力的关系之一,双曲函数，首先要进行无因次化处理：令 对于球形固定化酶，则有,整理：即：，利用边界条件求解：该方程无解析解，只有数值解（数值计算法是研究数学问题的一类近似解法，即从一组原始数据，按照某种确定的运算规则，进行有限步运算，最终获得数学问题数值形式的满足某种精度要求的近似解，如龙格库塔法，近似解也可做成图）,底物浓度沿半径分布图,从右图可以看出，对同一位置r处，随着的增加，底物浓度在减少。的大小，表征了内扩散阻力的大小，因此随内扩散阻力的增大，同一位置处底物浓度减小，而且当不变时，愈往颗粒内部，底物浓
11、度越小。当内扩散阻力较小时，0.2,1,底物可以到过颗粒中心处，但当内扩散阻力较大时，=5,10,底物还未达到颗粒中心处就反应掉了。,图,球状固定化酶之颗粒内底物浓度与阻力的关系之二,当，同样对 进行无因次化处理，得，同样给定边界条件进行求 解，得,球状固定化酶之颗粒内底物浓度与阻力的关系之三,当 对于零级反应动力学，反应速率与底物浓度无关，但要发生反应，必须有底物存在，同样给定边界条件对其进行求解，得当底物浓度一定时，使固定化酶颗粒中心处底物浓度恰好为0的颗粒半径，称为临界半径，,3.3.3.2 片状固定化酶,假定酶膜的厚度为2L，但厚度与其长度与宽度相比要小得多，因此底物的扩散只考虑与两个
12、大的侧面相垂直方向上的扩散，而忽略其他四个侧面的扩散，同样取一厚度为dl的微元体，做底物的物料衡算：假定酶膜的面积为A，则单位时间进入微元体底物量表示为 单位时间流出微元体的底物量为 单位时间内微元体内反应的底物量为,扩散方向,对底物进行物料衡算：流入流出反应消耗同样，底物沿扩散方向的浓度分布与rs的形式有关，当酶膜完全浸在反应液中时，若，同样进行无因次化处理，令 则上式变为，同样给定边界条件：同样此方程只有数值解，没有解析解。,当，无因次化处理得，解得 当 同样也存在临界厚度的问题：,3.3.4 内扩散有效因子,内扩散有效因子的定义一级反应动力学表达式有效因子的一般表达式零级反应表达式,3.
13、3.4.1 有效因子的定义,定义：在稳态条件下，RS应等于从颗粒外表面处向微孔扩散的速率，即 当无外扩散影响时，对于球状固定化酶，,3.3.4.2 一级反应,当，即而对于片状固定化酶,固定化酶形状对有效因子的影响,随着 的增加，下降，当，为动力学控制区，说明内扩散阻力很小，但当 3时，内扩散阻力明显，内扩散成为控制步聚，此时，为过渡区。此外，固定化酶几何形状不同，对 关系影响不大，特别是在 较小或较大时。,3.3.4.3 有效因子的一般形式,当 对于球状固定化酶，进行无因次化处理，则因为Sr之间无解析解，因此 亦无解析解，因而,由此可看出，当 增加时，下降，而，从中可以看出影响泰勒模数的因素：
14、1）颗粒大小或厚度，即，对 的影响明显，又称为特征尺寸，越大，值越大，越小，因此为了减少内扩散的影响的限制，反应中应尽可能采用小颗粒。2）颗粒活性，即动力学参数3）有效分子扩散系数,3.3.4.4 零级反应动力学,对于零级反应动力学，只要整个球形固定化酶颗粒内部有底物存在，反应就可以进行，此时，若由于内扩散的影响，使得底物在固定化酶颗粒某一位置r处浓度为0，则定义一个零级反应的泰勒模数，来计算零级反应的有效因子，定义：对于球形固定化酶，,3.3.5 表观泰勒模数,定义：，对于球形固定化酶，由 得当,3.4 扩散影响下的假象,扩散影响的判定扩散对反应级数的影响扩散对活化能的影响扩散对固定化酶稳定
15、性的影响,3.4.1 扩散影响的判定,直接法：如果在相同的反应条件下，只改变底物的流速，如果流速改变，底物的转化率也随之改变，说明存在外扩散的影响，继续提高流速，转化率不再改变，说明消除了外扩散的影响，在此基础上，维持相同的反应条件，只减少固定化酶的特征尺寸，随着特征尺寸的减少，底物的转化率增加，说明存在内扩散的影响，继续减少特征尺寸，直到底物的转化率不变，说明内扩散的影响消除。图解法：根据Arrhenius定理，因此如果存在内扩散的影响，则活化能减半，如果受外扩散的影响，活化能为0。,3.4.2 扩散对反应级数的影响,若酶反应的本征动力学可表示为，若只有内扩散有影响，则，两边取对数得，假定温度不变，K为常数，两边求导，同样，因此当无内扩散影响时，当内扩散影响严重时，当反应为外扩散控制时，不管n为多大，表现反应级数均为1,3.4.3 内扩散对活化能的影响,以一级不可逆为例：，当内扩散影响严重时，K及Des与温度的关系均可用阿氏定理表示，,3.4.4 扩散对固定化酶稳定性的影响,当只有内扩散影响时，假定酶的失活是由于活性酶总量下降引起的，而k+2不变，则对于球形固定化酶，,令 若酶的失活为一级失活，且为不可逆，则,
