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1、外源DNA,载体DNA,重组分子,原核细胞,真核细胞,扩增或表达,表达,连接,转化或转导,电穿孔或显微注射,受体细胞,第六章 基因的重组与转移,一、粘性末端的连接,第一节 DNA片段的体外连接,（一）同一种酶产生的黏性末端的连接,（二）不同种酶产生的黏性末端的连接,二、齐平末端（blunt end）的连接,5端与3端并列靠近的时间太短，不容易被连接酶连接。,1.直接连接,T4DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1%。,5,5,5,5,3,3,3,3,-OH,-OH,-P,-P,P-,P-,HO-,HO-,5,3,-OH,-P,P-,HO-,5,3,1972年，斯坦福大学的P
2、.Labban和P.Kaiser提出。,（1）同聚加尾 法,2.人工加尾形成“粘性末端”,DNA末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA的3-OH端加上脱氧核苷酸。,原理：,分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。,加尾碱基互补,缺点：,优点：,能把任何片段连接起来,不能把插入片段再切下来。,非酶切位点,用T4 DNA连接酶连到平端DNA上，然后再用酶切，形成一个人工粘性末端。,（2）衔接物(linker)连接,linker,用化学合成法合成的一段10-12bp的特定限制性内切酶识别位点序列的平端双链。,GGAATTCCCCTTAAGG,EcoRI linker：,linker的作用,缺点：,1）
3、可以用内切酶把插入片段切下来。,如果插入片段内部也有该酶位点，不能切下完整的插入片段,2）能给载体连接上Polylinker:,优点：,（3）DNA接头(adapter)连接法,1978年康内尔大学的吴瑞教授发明。,5p-GATCCCGG-OH3 GGCC-p5,BamHI adapter,用T4DNA连接酶连到DNA分子的两端，直接成为人工粘性末端。,adapter,一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）。,adapter的作用,Blunt-ended DNA,5p-GATCCCGG-OH3 HO-GGCC-p5,BamHI adapter,P-,-P,5p-GATCCCGG-GGC
4、C-,-CCGG-GGCCCTAG-P5,5p-GATCCCGG-GGCC-,CCGGGGCCCTAG-P5,CCGGGATCCCGG-OHGGCCCTAGGGCC-P5,接头自我连接,接头与接头会彼此以粘性末端接在一起，影响与DNA片段的连接。,优点：,连上后就能用。,缺点：,先用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理接头，水解掉其5端的磷酸，防止自我连接。（以后再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。）,防止自我连接,5p-GATCCCGG-OH HO-GGCC-P,P-CCGG-OHHO-GGCCCTAG-P5,CCGGGATCCCGG-OHHO-GGCCCTAGGGCC5,接头之间不能形成磷酸二酯键自我
5、连接！,5GATCCCGG-OH HO-GGCC5,5CCGG-OHHO-GGCCCTAG5,CIP处理,-OH,HO-,Blunt-ended DNA,5p-GATCCCGG-OH3 HO-GGCC-p5,BamHI adapter,P-,-P,5GATCCCGG-HO-GGCC,CCGG-OH-GGCCCTAG5,5GATCCCGG-OH3 HO-GGCC5,缺口,缺口,HO-,-OH,CIP处理,T4 ligase,虽然有缺口，但仍然能与DNA片断连接。,三、PCR产物的连接,1.在引物的5端设计酶切位点,符合载体的多克隆位点；,（1）设计原则,（2）带酶切位点的引物的结构,3端1520
6、bp与模板互补；5端610bp是某个内切酶的识别序列。,（5端多余的35bp属保护碱基）,避免与所扩增的DNA片断内部酶切位点重复。,引物1,GCAGAATTC,互补序列,模板,EcoRI位点,5-,-3,GCAGAATTC,互补序列,5-,-3,3,模板,GCAGAATTC,互补序列 PCR产物,5-,-3,3,复性,延伸,模板,模板,3,3,GCTAGCCGG,互补序列,模板,BamH I 位点,-5,3-,5,复性,延伸,模板,模板,3,3,GCTAGCCGG,互补序列,-5,3-,模板,5,GCTAGCCGG,PCR产物 互补序列,-5,3-,引物2,带酶切位点的PCR产物,GCAGA
7、ATTC,PCR产物,5-,-3,GCTAGCCGG,PCR产物,-5,3-,CGTCTTAAG,CGATCGGCC,EcoRI位点,BamHI位点,AATTC,PCR产物,5-,-3,GCTAG,PCR产物,-5,3-,G,C,EcoRI,BamHI,两头各有一个粘性末端！,2.与T载体直接连接,（1）PCR产物两个3端一般都有一个A,Taq DNA聚合酶的特性：在DNA双链的3端再加上一个多余的核苷酸（优先加A）。,（2）T载体的两个3端人为地各加一个T,利用Taq DNA聚合酶，当原料中只有dTTP时，被迫在平端载体上添加T！,A,A,dNTP,T,T,dTTP,Taq DNA聚合酶,载
8、体,PCR产物,TA,TA,四、DNA体外连接应注意的事项,插入片断与载体的酶切位点互补,相同的粘性末端才能有效地连接。,尽量避免平端连接。,决不能进行非粘性末端连接。,EcoRI,EcoRI,EcoRI,（1）用相同的酶切,（2）用同尾酶切,BamHI、BclI、BglII、Sau3AI、XhoII,都产生GATC4个碱基的粘性末端。,2.DNA插入的方向正确,用双酶切,由于产生的粘性末端不同，只能以固定方向连接。,EcoRI,BamHI,EcoRI,BamHI,EcoRI,BamHI,3.插入基因的开放阅读框（ORF）正确,（1）DNA定向插入,（2）起始密码,尤其当载体上有ATG起始密码
9、的时候，更要注意。,ATGGAATTC,载体,ATGCGGAATTCT,插入片断,EcoRI,EcoRI,ATGGAATTC T,重组,但移码突变！,4.防止载体自身环化连接,（1）提高插入片断的用量,连接反应体系中，插入片断比载体多10倍以上。,（2）用碱性磷酸酶处理载体,载体切口的5磷酸被除去，不能自我连接。但可以与插入片断以单链连接。,5,3,载体,插入片断,1.载体自身环化连接（能存活）,2.载体之间互相连接（能存活）,3.插入片段互相连接（不能存活）,4.一个载体与几个插入片段重组（能存活）,五、载体和外源DNA插入片段的连接结果,5.几个载体与一个插入片段重组（能存活）,1.目的,
10、增加受体菌细胞膜的通透性。,第二节 重组体导入细菌细胞,一、感受态大肠杆菌的制备,使用丧失了限制体系的大肠杆菌。如K12系列的大肠杆菌。,2.菌种,用CaCl2处理大肠杆菌，能增加膜的通透性。,3.制备原理,4.制备过程,培养大肠杆菌,OD600,On ice 5-10 min,4离心收集菌,用冰冷的60mMCaCl2重悬,4离心收集菌,4离心收集菌,分装、-70 冻存,用冰冷的60mMCaCl2重悬,On ice 30 min,用冰冷的60mMCaCl2重悬,二、重组DNA导入大肠杆菌,（1）转化（transformation),大肠杆菌捕获质粒DNA的过程。,（2）转染（transfect
11、ion),大肠杆菌捕获噬菌体DNA的过程。,1.外源DNA导入细菌的几种方法,（3）转导（transduction),借助噬菌体把外源DNA导入细菌的过程。,3.转化方法,2.转化率,简单，但转化效率不高（106-108/gDNA）。,（1）热休克法（heat shock）,转化效率高（高于109/gDNA）。,（2）电转化法,转化率是指DNA分子转化受体菌获得转化子的效率，有两种表示方式：一是以转化子数与用于转化处理的DNA分子数或质量的比率表示；二是以转化子数与用于转化处理的受体细胞数的比率表示。用每单位质量的DNA分子获得的转化子数来表示，难以反映分子大小与转化率之间的关系。,10ng载
12、体DNA,100L感受态菌,On ice混合，静置10分钟,42C 1分钟,加入1mL LB培养基,37摇1小时,10-100L转化液涂含抗菌素的平板,吸附DNA,摄入DNA,（1）热休克法,LB培养受体菌至OD600,冰浴15分钟，2C离心集菌,冰冷的水重悬菌体,2C离心集菌,冰冷的水重悬菌体,2C离心收集菌体,少量冰冷的水重悬,分装成50-300L,电转仪调为2.5kV,25F,脉冲控制器200-400,0.5g质粒DNA,On ice混合,加入1mLSOC培养液,37C中速震荡60分钟,10-100L转化液涂含抗菌素的平板,转化,（2）电转化法,4.平板培养基培养细菌,10-100L转化
13、液,涂于含抗菌素的平板,37过夜,5.影响转化率的因素,(1)分子质量较小的重组质粒DNA分子转化率较高，分子质量较大的重组质粒DNA分子转化率较低，对于大于15kb的重组质粒则很难进行转化。(2)组成重组DNA分子的载体类型及其构型。与受体细胞亲和性较强的质粒载体转化率要高于亲和性较弱的质粒载体，而处于自然双螺旋闭环结构的质粒载体比开环结构、成线性结构的质粒载体有更高的转化率。(3)重组DNA分子的浓度和纯度。在10ng100u1以下的DNA浓度范围内，转化效率与DNA分子数成正比关系。,生长状态,制备感受态菌必须使用对数生长期的菌。,必须在冰冷的条件下制备。,要充分，使细菌细胞膜失去一些蛋
14、白。,储存感受态菌要在-70以下,CaCl2处理,使用感受态菌时必须迅速融化,融化后一般不能再次冻存使用。,（4）感受态细胞（competent cells),把重组的噬菌体DNA或Cosmid质粒DNA包装成具有感染能力的噬菌体颗粒。,6.体外包装的噬菌体的转导,（1）体外包装（in vitro packaging）,（2）转导（transduction）,通过受体菌细胞表面的DNA接受器位点（receptor site)，使带有外源基因的重组体DNA注入受体大肠杆菌进行扩增。,cI857基因是个温度敏感性阻遏蛋白基因，感染细菌后，在32下培养细菌时能够保持溶源性。但当温度升高到4445时，
15、就会导致cI基因编码的阻遏蛋白失活，DNA复制、外壳蛋白合成。便于提取外壳蛋白。,（3）cI857基因突变的噬菌体,但由于该噬菌体的S基因上有一个突变，所以细菌还不裂解。,cI857,其它基因,溶源状态（DNA不转录、不翻译）,DNA,阻遏蛋白,阻遏蛋白,4445,DNA转录、翻译合成外壳蛋白,32,噬菌体1,外壳蛋白基因E发生了无义突变，不能合成头部蛋白，但能合成其它外壳蛋白（尾部蛋白）。,在cI857基因突变的噬菌体的基础上，选择两种外壳蛋白的突变型噬菌体。,（4）互补型噬菌体,外壳蛋白基因D发生了无义突变，不能合成头部的包装识别蛋白，但能合成其它外壳蛋白（头部、尾部蛋白）。,噬菌体2,(
16、5)体外包装过程,体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，使受体菌发生溶菌，形成噬菌斑。（每g DNA能形成106噬菌斑）。,（6）转导,转化率高的菌株；有突变的菌株（与导入的载体基因互补）；不育的菌株（不会与其他酵母接合）。,第三节 外源基因导入真核细胞,一、导入酵母细胞,1.菌株选择,如：ura3-52,trp1-289,leu2-3,leu2-112,his31,（1）利用原生质球进行转化,2.酵母的转化方法,酵母,原生质体,感受态,酶去壁,CaCl2、PEG,插入外源基因的酵母载体,PEG（聚乙二醇）使细胞壁具有通透性，允许DNA进入。CaCl2使细胞膜具有通透性，允许DNA进入。,转化,酵
17、母,0.1mol/L LiCl处理,插入外源基因的酵母载体,感受态,40%PEG 4000,（2）利用Li+盐进行转化,农杆菌介导的Ti质粒载体转化法DNA直接转移法,二、导入植物细胞,（1）农杆菌介导的Ti质粒载体转化法,用于植物基因转化操作的受体通常称为外植体；一般从以下几个方面选择合适的转化外植体：优先考虑叶片、子叶、胚轴等材料幼年期外植体转化的外植体易培养，并有较强的再生能力注意易被转化的分生组织感受态细胞所在的部位及其数量。,外植体的农杆菌接种,把农杆菌接种到外植体的损伤切面；方法：将切成小块的外植体浸泡在准备好的工程菌液中，浸泡一定时间后，转至无菌的吸水纸上，吸干外植体非伤口面的菌
18、液，再进行共培养。,将接种农杆菌后的外植体培养在诱导愈伤组织或不定芽固体分化培养基上，随着外植体的细胞分裂和生长，农杆菌在外植体切口面也进行着增殖生长，故该培养过程称之为农杆菌与外植体的共培养。在此期间完成农杆菌的附着浸染、T-DNA的转移及整合。,脱菌培养把共培养后的外植体转移到含有抗生素的培养基上继续培养生长，达到抑制和杀死农杆菌。头孢霉素脱菌培养时间，一般需56次继代培养，甚至一直到试管苗形成。,另外，还需将外植体转移至筛选培养基上继续培养，筛选出被转化的细胞，经再分化培养成再生植株。,几种常用的农杆菌Ti质粒转化方法,叶盘转化法植株接种共转化法植物愈伤组织共培养转化法原生质体共培养转化
19、法植物悬浮细胞培养转化法,叶盘法转化植物细胞,Leaf dish transformation由Horsch等于1985年发展起来的一种转化方法,叶盘法操作程序：,叶片表面除菌打孔器制备圆形叶片，即叶盘叶盘于农杆菌液浸泡数秒钟叶盘平铺培养平皿滤纸培养2天筛选长芽培养基进行筛选与再生培养生根培养基上诱导幼芽生根小植株移栽在土壤中,植物原生质体的再生程序,（2）DNA的直接转移法,物理方法：电穿孔法基因枪法显微注射法超声波介导转化法激光微束穿孔法,化学方法：多聚物介导法脂质体介导法,生物方法：花粉管通道法,原理：细胞生物学研究证明，细胞膜的磷脂双分子层可视为一种电容，其静膜电位（Vm）约为l00m
20、V，导电性很差。当把细胞置于外加电场中时，会使膜电位升高，双分子层两端电压形成差势，随着外加电场电压升高，细胞膜被压缩变薄，当膜电压升到一定数值时，膜被击穿。,可逆击穿：击穿小孔可在一定时间内复原。,不可逆击穿：击穿小孔不可修复，处理细胞成活率低。,电穿孔法（electroporation),植物细胞,原生质体,纤维素酶和果胶酶,DNA,混合入电击缓冲液,1-2kV,3-25F电击,愈伤组织,幼苗,分化,又称高速微型子弹射击法（High-velocity microprojectiles),DNA,1.2m钨弹头,吸附,特制手枪,射击植物,装入,基因枪法（gene gun）,基因枪法的特点：,
21、（2）受体广泛。,（3）操作简单。,（1）转化效率高。,指在显微镜下，将DNA由细胞玻璃针直接注入细胞。可以将DNA直接注入核内而减少溶酶体对外源DNA的降解，有助于基因的整合与表达。适用于多种贴壁生长细胞及悬浮生长细胞，包括原代及传代细胞、胚胎细胞等。,显微注射法(microinjection),超声波介导转化法利用低音强脉冲超声波的物理作用，可逆性地击穿细胞膜并形成膜通道，使外源DNA进入细胞。激光微束穿孔转化法,化学法,多聚物介导法 多聚物（如聚乙二醇、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸等）和二价阳离子（如Mg2+、Ca2+、Mn2+）与DNA混合，能在原生质体表面形成沉淀颗粒，通过原生质体的内吞噬
22、作用而被吸收进入细胞内。,脂质体（lipofectin）载体法,脂类包埋DNA，通过细胞膜进入细胞。,花粉管通道法 把外源DNA涂于授粉的枝头上，使DNA沿花粉管通道或传递组织通过珠心进入胚囊，转化还不具有正常细胞壁的卵、合子及早期的胚胎细胞。,三、导入哺乳动物细胞,病毒颗粒转染法磷酸钙转导法聚阳离子-DMSO转染法脂质体介导法电穿孔法显微注射技术,生物法,病毒颗粒转导法带有目的基因的病毒颗粒直接感染受体细胞；然后整合到染色体上。带有目的基因的缺陷载体辅助病毒一起感染受体细胞，可形成病毒颗粒。带有目的基因的SV40早期转录缺陷载体，感染COS细胞系。,化学法,磷酸钙转染法DEAE-葡聚糖转染法
23、聚阳离子-DMSO转染法脂质体介导法,（1）原理：,磷酸钙沉淀法,当CaCl2、DNA和磷酸盐缓冲液缓慢混合时，即有磷酸钙微细沉淀形成，这些细小颗粒可以吸附在细胞表面，通过细胞膜的内吞作用将DNA吸收进入细胞质面后进入细胞核，其详细机制尚不明确。DNA多以多拷贝首尾相连的串珠状排列进入细胞，在细胞中常以多拷贝形式存在。,依据不同的细胞类型，平皿上最多能有10%的细胞能吸收DNA沉淀。,不需要载体。,（2）特点：,该方法操作简单，又不需特殊仪器，瞬间转移效率最高可达到20，但长期表达效率较低，目前已被广泛运用于离体细胞的基因转移，是最普遍使用的方法之一。,二乙氨乙基（diethyl-aminoe
24、htyl，DEAE）葡萄糖能促进哺乳动物细胞摄入外源DNA。,DEAE-葡萄糖传染法,葡聚糖,葡聚糖+DNA,吸附到细胞表面后被细胞吞入，部分DNA可以进入到细胞核里。,DEAE-dextran,细胞,外源DNA,预处理,摄入,DEAE-dextran,外源DNA,细胞,混合,DEAE-dextran对细胞有毒!,聚阳离子-DMSO转染法,采用聚阳离子poly-brene处理哺乳动物细胞，增加细胞表面对DNA的吸附能力、然后再用25-30DMSO短暂处理细胞，增加膜的通透性，提高对DNA的捕获量。,脂质体有商业试剂盒（如Life Technologies）。,脂质体（lipofectin）载体法,脂类包埋DNA，通过细胞膜进入细胞。,物理法,显微注射转基因法电穿孔DNA转移法,
