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1、第二章 植物组织培养,第一节 植物组织培养原理及应用,第二节 植物组织培养的基本条件,第三节 外植体的选择与消毒,第四节 无菌技术,百合,蝴蝶兰,马铃薯,草莓,葡萄,新疆无花果,第一节 植物组织培养原理及应用,一、植物组织培养定义及特点,1、定义 指在无菌条件下，将植物体的任何一部分（外植体），如器官、组织、细胞以及原生质体等，培养在人工配制的培养基上，并给予合适的培养条件，使之发育成完整植物体的过程。由于组织培养是在脱离母体的条件下进行的，所以也称作离体培养。,2、植物组织培养的类型,愈伤组织培养细 胞 培 养器 官 培 养原生质体培养分生组织培养,最为常见的组织培养,单细胞培养,胚、胚乳、
2、珠心、子房、根、茎、叶、花和幼果的部分组织的培养,茎尖、根尖等,愈伤组织(callus)原指植物体的局部受到创伤刺激后，在伤口表面新生的组织。它由活的薄壁细胞组成，可起源于植物体任何器官内各种组织的活细胞。,3、植物组织培养特点,培养条件可以人为控制 组织培养采用的植物材料完全是在人为提供的培养基质和小气候环境条件下进行生长，摆脱了大自然中四季、昼夜的变化以及灾害性气候的不利影响，且条件均一，对植物生长极为有利，便于稳定地进行周年培养生产。,生长周期短，繁殖率高 植物组织培养是由于人为控制培养条件，根据不同植物不同部位的不同要求而提供不同的培养条件，因此生长较快。另外，植株也比较小，往往20-
3、30天为一个周期。所以，虽然植物组织培养需要一定设备及能源消耗，但由于植物材料能按几何级数繁殖生产，故总体来说成本低廉，且能及时提供规格一致的优质种苗或脱病毒种苗。,管理方便，利于工厂化生产和自动化控制 植物组织培养是在一定的场所和环境下，人为提供一定的温度、光照、湿度、营养、激素等条件，既利于高度集约化和高密度工厂化生产，也利于自动化控制生产。它是未来农业工厂化育苗的发展方向。它与盆栽、田间栽培等相比省去了中耕除草、浇水施肥、防治病虫害等一系列繁杂劳动，可以大大节省人力、物力及田间种植所需要的土地。,二、植物组织培养的基本原理,1、植物细胞全能性（Totipotency）植物细胞全能性：19
4、02年由Haberlandt提出，即植物细胞在适当的条件下，具有不断分裂和繁殖、发育成完整植株的能力。,从一个细胞发育成一个植株,基础：细胞内具有该物种发育所需的全部遗传物质。细胞全能性的高低：受精卵生殖细胞体细胞植物细胞动物细胞分化程度低的细胞分化程度高的细胞细胞分化的实质：基因的选择性表达。,全能性的表达 少数体细胞在发育过程中可能丢失一部分遗传物质,因而失去全能性。如筛管细胞,它在发育过程中失去细胞核,因而没有全能性。目前还无法使所有的离体植物细胞都实现其全能性。,离体状态营养物质激素适宜外界条件,条件,无机营养,有机营养,生长素,细胞分裂素,在离体培养的选材上，尽可能选取分生组织的部位
5、。将实验目的与外植体生长发育状态相结合，创造良好的离体条件。合理使用生长调节物质。,2、细胞分化（Cell differentiation）,概念（1）分化：是指植物体各个部分出现异质性的现象，包括细胞分化、组织分化和器官分化。（2）细胞分化：指同一来源的细胞逐渐产生出形态结构、功能特征各不相同的细胞类群的过程，其结果是在空间上细胞产生差异，在时间上同一细胞与其从前的状态有所不同。细胞分化是组织分化和器官分化的基础，是植株离体再生的基础。细胞分化的实质：基因的选择性表达。,植物细胞分化的某些规律和机理,（1）细胞分化基本分为形态结构分化和生理生化分化两类，生理生化分化在形态结构分化之前。（2）
6、分化与极性（Polarity）关系密切。（3）生理隔离或机械隔离在细胞分化中有促进作用。（4）细胞分裂对细胞分化具有重要作用。（5）植物生长调节剂有明显调节作用。如生长素与分裂素比值，高，促进生根；低，促进长芽。（6）染色体和DNA的变化对细胞分化影响较大。,3、脱分化（Dedifferentiation）概念：也称去分化，指离体条件下生长的细胞、组织或器官经过细胞分裂或不分裂逐渐失去原来的结构和功能而恢复分生状态，形成无组织结构的细胞团或愈伤组织的过程。,（1）损伤。切割损伤的刺激，促使细胞增殖。（2）激素。在诱导愈伤组织时常加入生长素类，同时配合细胞分裂素的效果可能更好。（3）光照。弱光或
7、黑暗条件有利于脱分化中的细胞分裂。（4）细胞位置。外植体本身的各类细胞可能对培养条件的刺激有不同的敏感性。（5）外植体的生理状态。不同生理年龄和不同季节都会有不同的培养反应。（6）植物种类的差异。一般双子叶植物比单子叶植物及裸子植物容易。,影响脱分化的主要因素,4、愈伤组织（Callus）培养,愈伤组织生长过程 在脱分化的过程中，多形成Callus,其细胞结构无明显极性。（1）诱导期：细胞准备进行分裂，细胞大小几乎不变，生理生化变化大，迅速合成蛋白质和核酸。（2）分裂期：外层细胞分裂，中间细胞常不分裂，形成小芯。细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明。在原培养基上，细胞会发生分化，及时转移，其可无
8、限制地进行细胞分裂，维持不分化状态。（3）分化期：细胞发生生理代谢变化，出现形态和功能各异的细胞。,愈伤组织的生长特性,（1）生长：诱导期后，外植体外层细胞分裂，在受伤组织表面形成一层愈伤组织，Callus的细胞数目迅速增多，表层细胞平均重量下降，体积变小；降低温度，可以使细胞生长速度减慢，平均大小可增加。（2）质地类型：松脆和致密两种。高浓度生长素，可使Callus变得松脆（非胚性愈伤组织）；高浓度细胞分裂素，则可使其致密（胚性愈伤组织）。（3）生理生化变化：RNA,愈伤组织的继代培养,在多数情况下，随着培养时间的延长，Callus长势下降、褐变、分化和形态发生能力下降甚至死亡。主要原因：染
9、色体畸变，基因突变，生理因素（代谢产物），细胞或组织内激素平衡的改变，细胞对外源生长物质的敏感性改变，培养基损耗等。,愈伤组织形态发生,（1）准备：外层细胞分裂逐渐减慢并停止；内部较深处的细胞开始分裂，而且分裂方向也发生改变，形成维管化组织和瘤状结构。（2）形态发生方式：不定芽方式和胚状体方式。胚状体的形成又可分为直接发生和间接发生,5、再分化（Re-differentiation）,概念：指离体培养的植物细胞和组织可以由脱分化状态重新进行分化，形成另一种或几种类型的细胞、组织、器官，甚至形成完整植株。（1）细胞水平再分化：细胞壁变厚、假导管细胞的形成，酶水平的变化和明显的机能分化，从而形成各
10、种类型的细胞。（2）组织水平再分化：在高水平生长素条件下，最常见的是维管组织（Vascular tissue）的分化.,（3）器官水平再分化：依起源不同，分器官型（Organ）和器官发生型（Organogenesis）。器官型：直接由外植体细胞形成器官原基，继而发育成器官；器官发生型：外植体先形成愈伤组织，再由愈伤组织产生不同的器官原基。,（4）植株再生：根和茎（包括其变态器官）或芽器官的发生可使植株重建。器官发生再生植株的方式大致有：A 先形成芽，芽的基部后产生根；B 先形成根，根上再出芽；C 愈伤组织的不同部位形成芽和根，然后形成维管束把两者结合起来.一些变态茎、叶器官，离体培养易于形成相
11、应的变态器官。,影响细胞再分化因素：从理论上讲，在离体培养条件下经过再分化可获 得各种类型的细胞、组织、器官以及再生植株。但是目前，还不能使所有植物的活细胞都再生植株。主要原因是：（1）不同植物种类再分化的能力差异较大（遗传背景）；（2）对某些植物再生条件还没有完全掌握。渗透压、酸碱度、湿度、温度、光照、营养条件等。,三、植物组织培养的发展简史,探索阶段（1902-1929年）奠基阶段（1930-1960年）迅速发展阶段（1960-1980）生产上广泛应用阶段(1980-今）,四个阶段,1.探索阶段（1902-1929年）,Haberlandt：,贡献：,提出细胞全能性假说,小野芝麻和凤眼兰的
12、栅栏细胞和虎眼万年青属表皮细胞,无分裂,细胞高度分化+培养基中无生长激素,首次进行离体细胞培养,Knop+蔗糖,关于植物细胞培养实验,我愿意指出：在我的培养实验中，虽然经常观察到细胞的明显生长，但从未观察到细胞分裂。发现单细胞培养的条件，将是未来培养试验的难题。在未来，人们可以成功地从营养细胞培养出人工胚。,1904年：Hanning胚培养：培养萝卜和辣根菜的胚，得到植株,1922年：Kotte和Robbins根培养,1925年：Laibach亚麻种间杂交幼胚培养得到杂种,其它研究,1922年：Knudson采用胚培养法获得兰花幼苗，克服其种子发芽困难的问题。,2.奠基阶段（1930-1960
13、年）,1934年：White培养番茄根，产生愈伤组织,1934年：Gautherete培养山毛杨、黑杨形成层组织产生了Callus,1937年：White发现3种B族维生素和IAA对植物生长有用,1939年：Gautherete培养胡萝卜根小外植体成功,1939年：White培养烟草种间杂种幼茎切段原形成层成功,1939年：Nobecourt培养胡萝卜根块茎薄壁组织成功,1943年：White植物组织培养手册A Handbook of Plant Tissue Culture，标志组织培养成为一门新兴学科,1946年：罗士韦在菟丝子茎尖培养地观察到花的形成，为试管受精奠定了基础,1948年：S
14、koog和崔真培养烟草茎段时，发现腺嘌呤或腺苷可解除生长素对芽生长的抑制作用。,1952-1953年：美国科学家Steward F.C.用胡萝卜根的细胞悬浮 培养，发现单个细胞能象受精卵发育成胚一样的途径，发育成完整植抹，证实了植物细胞全能性学说。1952年：Morel和Martin首次报道茎尖分生组织的离体培养，获得无病毒大丽花植株。1954年：Muir将烟草愈伤组织置于固体培养基上，在其上放一片滤纸，再在滤纸片上放上一 个烟草体细胞，单细胞培养成功。1956年：Miller分离出Kinetin，Kinetin/激动素,组织培养的奠基人,3、迅速发展阶段（1960-1980）,1960年以来
15、组织培养理论、实践、技术和方法不断完善和发展，形成独具特色的专业技术在实验技术上建立了较完整的实验程序，已成为一种重要和精细的实验技术组织培养已广泛应用于生物学的许多分支学科，并取得丰硕的成果。,花卉的快繁：蝴蝶兰花药培养：中花8号水稻、京花1号小麦。体细胞无性系变异：在植株上发生的体细胞变异，未必都能通过性细胞传递到后代，也未必都能通过枝条等营养器官体现在无性繁殖的后代中。为了筛选那些潜在的有利变异，科学家试图通过在植物体外培养植物细胞，使它们成为大群体的植株，从而将细胞发生的变异表现出来。这些体细胞通过形成愈伤组织然后再生的植株群体，称为体细胞无性系，在该群体中出现的变异称为体细胞无性系变
16、异。体细胞无性系变异主要包括基因突变和染色体的结构变异和数目变异。可发生在体外培养之前，也可发生在体外培养过程之中。通过筛选体细胞无性系变异，曾得到优良的小麦品种和花色改变的菊花等。突变体诱导和筛选：细胞突变体的筛选最早始于1959年，G，Melchers在金鱼草悬浮细胞培养中获得了温度突变体。迄今为止，不少于15个科、45个种的植物细胞培养中筛选出100个以上的细胞突变体或变异体，有抗病细胞突变体、逆境胁迫抗性突变体、抗除草剂细胞突变体及营养缺陷型细胞突变体等。,4.组织培养在生产上广泛应用阶段（1980年-今）,四、植物组织培养的过程,1.初代培养芽、茎段、叶片、花器等外植体在离体培养条件
17、下诱导愈伤组织、不定芽或胚状体的过程。,返回,2.继代培养：将初代培养得到的培养体移植于新鲜培养基中这种反复多次移植的培养，称为继代培养。,3.生根培养：将芽苗转接到生根培养基上培养成为完整植株的过程。,4.驯化移栽：组培苗经人工炼苗后移栽到驯化苗床上使之适应 露地或保护地条件的过程。,离体的植物器官、组织、细胞,脱分化,愈伤组织,再分化,根芽,植物体,植物组织培养过程,植物组织培养条件：,含有全部营养成分的培养基、一定的温度、空气、无菌环境、适合的pH值、适时光照等。,再生植株的优点：一、发生数量多二、培养周期短三、结构完整，成苗率高四、遗传背景一致,五、植物组织培养的应用,植物组织培养成为
18、生物科学的一个广阔领域，除了在基础理论的研究上占有重要地位以外，在生产中也得到越来越广泛的应用。,1.快速繁殖种苗 用组织培养的方法进行快速繁殖是生产上最有潜力的应用，包括花卉观赏植物、蔬菜、果树、大田作物及其他经济作物。快繁技术不受季节等条件的限制，生长周期短，而且能使不能或很难繁殖的植物进行增殖。,2.无病毒苗(virus free)的培养 植物在生长过程中几乎都要遭受到病毒病不同程度的危害，有的种类甚至同时受到数种病毒病的危害，尤其是很多园艺植物靠无性方法来增殖，若蒙受病毒病，代代相传，越染越重，甚至会造成极严重的后果。,自从Morel l952年发现采用微茎尖培养方法可得到无病毒苗后，
19、微茎尖培养就成为解决病毒病危害的重要途径之一。若再与热处理相结合，则可提高脱毒培养的效果。对于木本植物，如果茎尖培养得到的植株难以发根生长，则可采用茎尖微体嫁接的方法来培育无病毒苗。,3.育种上的应用(breeding)植物组织培养技术为育种提供了许多手段和方法，使育种工作在新的条件下更有效的进行。,1.倍性育种，缩短育种年限，杂种优势明显。,2.克服远缘杂交的不亲合性和不孕性（胚挽救、体细胞杂交）,3.保存种质,4.工厂化育苗(industrializing propagation)近年来，组织培养育苗工厂化生产已作为一种新兴技术和生产手段，在园艺植物的生产领域蓬勃发展。,要揭开生命活动的秘
20、密，需要多科学、多技术的相互配合，其中植物组织培养技术是不可缺少的，它为遗传学、分子生物学、细胞生物学、基因工程等方面的研究提供了一种有效、快速的方法。,5、在遗传学、分子生物学、细胞生物学、组织学、胚胎学、基因工程等方面的应用,6、用于其它未知科学的研究 现代科学发展非常迅速，很多现在预想不到的事情都有可能发生，新发明、新发现、新创造层出不穷，今天认为不可能的东西明天就可能变成现实，植物组织培养也同样具有许多尚未发掘出的潜力。总之，现在的植物组织培养仍然处于发展阶段，远远没有达到它的高峰期，很多机理人们还没有搞清楚，它的潜力还远远没有发挥出来。相信在今后的几十年内，组织培养将会有更大的发展，
21、在农业、制药业、加工业等方面将会发挥更大的作用，创造出更大的经济效益。,第二节 植物组织培养的基本条件,一、实验室及主要设备 在进行植物组织培养工作之前，首先应对工作中需要哪些最基本的设备条件有个全面的了解，以便因地制宜地利用现有房屋，或新建、改建实验室。实验室的大小取决于工作的目的和规模。以工厂化生产为目的，实验室规模太小，则会限制生产，影响效率。,在设计组织培养实验室时，应按组织培养程序来设计，避免某些环节倒排，引起日后工作混乱。植物组织培养是在严格无菌的条件下进行的。要做到无菌的条件，需要一定的设备、器材和用具，同时还需要人工控制温度、光照、湿度等培养条件。,1、实验室设计原则：保证无菌
22、操作，达到工作方便，防止污染。培养室减少通风 具有缓冲室2、实验室组成及其功能：化学实验室、洗涤室、无菌操作室（接种室）、培养室、细胞学实验室和温室或大棚。,无菌操作室（接种室）：主要用于植物材料的消毒、接种、培养物的转移、试管苗的继代、原生质体的制备以及一切需要进行无菌操作的技术程序。主要设备：紫外光源、超净工作台、消毒器、酒精灯、接种器械（接种镊子、剪刀、解剖刀、接种针）等。,接种室宜小不宜大，要求地面、天花板及四壁尽可能密闭光滑，易于清洁和消毒。配置拉动门，以减少开关门时的空气扰动。接种室要求干爽安静，清洁明亮。在适当位置吊装12盏紫外线灭菌灯，用以照射灭菌。最好安装一小型空调，使室温可
23、控，这样可使门窗紧闭，减少与外界空气对流。接种室应设有缓冲间，进入无菌操作室前在此更衣换鞋，以减少进出时带入接种室杂菌。缓冲间最好也安一盏紫外线灭菌灯，用以照射灭菌。,灭菌设备：高压蒸气灭菌锅用于培养基、蒸馏水和接种器械的灭菌消毒。工作原理：在密闭的蒸锅内，0.1 MPa的压力下，锅内温度达121。在此蒸气温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。,使用方法：首先检查灭菌锅内是否有水，而且水刚好淹住加热器，然后放入灭菌材料，对称拧紧灭菌锅上的螺丝，关闭放气阀通电。待压力上升到0.05MPa时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。三次放气后，关阀再通电，压力表上升达时，
24、维持20min后，断电，待压力降至零时，打开入入气阀，取出灭菌材料。注意对高压灭菌后不变质的物品，如无菌水、栽培介质、接种用具，可以延长灭菌时间或提高压力。而培养基要严格遵守保压时间，既要保压彻底，又要防止培养基中的成分变质或效力降低，不能随意延长时间；对于一些布制品，如实验服、口罩等也可用高压灭菌。洗净晾干后用耐高压塑料袋装好，高压灭菌20-30min；高压灭菌前后的培养基，其pH值下降单位。因此，调PH值时，可适当调高0.10.3个单位。,接种设备：超净工作台用于培养材料的消毒及接种。使用前，将超净工作台上面的排风和杀菌按钮开启，灭菌15min后，关闭杀菌按钮，打开照明按钮，即可在台面进行
25、操作。,电炉,推车,酒精灯,封口膜,接种器具,灭菌器,培养瓶,培养室：培养室是将接种的材料进行培养生长的场所。培养室的大小可根据需要培养架的大小、数目、及其他附属设备而定。其设计以充分利用空间和节省能源为原则，周围墙壁最好有绝热防火的性能。培养材料放在培养架上培养。培养架大多由金属制成，一般设5层，最低一层离地高约l0cm，其他每层间隔30cm左右，培养架即高1.7m左右。培养架长度都是根据日光灯的长度而设计，如采用40W日光灯，则长1.3m，30W的长lm，宽度一般为60cm。,培养室最重要的因子是温度，一般保持在20-27左右（安装空调）。由于热带植物和寒带植物等不同种类要求不同温度，最好
26、不同种类有不同的培养室。室内湿度也要求恒定，相对湿度以保持在70%80%为好，可安装加湿器。控制光照时间可安装定时开关钟，一般需要每天光照10-16h，也有的需要连续照明。短日照植物需要短日照条件，长日照植物需要长日照条件。某些组培实验室设计为采用天然太阳光照作为主要能源，这样不但可以节省能源，而且组培苗接受太阳光生长良好，驯化易成活。在阴雨天可用灯光作补充。主要设备：培养架、摇床、培养箱、紫外光源等。,培养设备带日光灯的培养架，主要用于接种后材料的培养。,恒温箱：又称培养箱，可用于原生质体和酶制剂的保温，也可用于组织培养材料的保存及暗培养。,摇床与转床：在液体培养基中，可改善培养基中的培养材
27、料的通气状况，可从疏松的愈伤组织中获得单个细胞，但注意要设定适合的温度及转速。,细胞学实验室：用于对培养物的观察分析与培养物的计数等。主要设备：双筒实体显微镜、显微镜、倒置显微镜等。其他小型仪器设备：分注器、血球计数器、移液枪、过滤灭菌器、电炉等加热器具、磁力搅拌器、低速台式离心机等。,显微镜包括解剖镜，生物显微镜，倒置显微镜等。如茎尖的分离则需要解借助解剖镜。,分注器,血球计数器,移液器,磁力搅拌器,低速台式离心机,驯化设备,温室 防虫网室,其它辅助设备,培养基灌装机及洗瓶机,除湿机：使培养室的湿度保持在定的范围内。,空调机：用于接种室和培养室温度的控制。,烘箱：用于干燥洗净后的玻璃器皿，还
28、可用80的温度烘干组织培养植物材料以测定干物质。,冰箱：用于在常温下易变性或失效的试剂和母液的储藏，细胞组织和试验材料的冷冻保藏，以及某些材料的预处理。,纯水机与蒸馏水发生器：是实验室必备的仪器。,天平：天平包括分析天平，电子天平，药物天平等，用于制备母液时培养基组成成分的称取。如一些需要量少的激素和微生素类物质，天平的精确度要到0.0001g，这就要求精确度更高的分析天平。,pH计：用于校正培养基和酶制剂的pH值。,二、培养基,1、培养基(culture medium)的含义 培养基是人工配制的能够提供微生物、植物和动物的细胞、组织进行生长所需营养物质的基质。在离体培养条件下，不同植物的组织
29、对营养有不同的要求，甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同，只有满足了它们各自的特殊要求，它们才能很好地生长。因此，没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官，在建立一个新的培养体系时，首先必须找到一种合适的培养基，培养才有可能成功。,Sacks(1680)和Knop(1681)对绿色植物的成分进行了分析研究，根据植物从土中主要是吸收无机盐营养，设计出了由无机盐组成的Sacks和Knop溶液，至今仍在作为基本的无机盐培养基得到广泛应用。以后根据不同目的进行改良产生了多种培养基，White培养基在40年代用得较多。而到60和70年代则大多采用MS等高浓度培养基，可以保证培养材料对营
30、养的需要。由于浓度高，在配制、消毒过程中某些成分有些出入，也不致影响培养基的离子平衡。,2、培养基的种类,培养基的名称，一直根据沿用的习惯。多数以发明人的名字来命名，如White培养基，Murashige和Skoog培养基(简称MS培养基)。,目前国际上流行的培养基有几十种，常用的培养基及特点如下：,MS培养基 它是1962年由Murashige和Skoog为培养烟草细胞而设计的。特点是无机盐和离子浓度较高，为较稳定的平衡溶液。其养分的数量和比例较合适，可满足植物的营养和生理需求。它的硝酸盐含量较其他培养基为高，广泛地用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养，效果良好。有些培养基是由它演变而来
31、的。,B5培养基 是1968年由Galmborg等为培养大豆根细胞而设计的。含有铵盐，这可能对一些培养物的生长有抑制作用。从实践得知有些植物在B5培养基上生长更适宜，如双子叶植物特别是木本植物。,White培养基 是1943年由White为培养番茄根尖而设计的。1963年又作了改良，提高了MgSO4的浓度，增加了硼素。其特点是无机盐含量较低，适于生根培养。,N6培养基 是1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的。其特点是成分较简单，KNO3和（NH4）2SO4含量高。在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花药培养和其他组织培养。,KM-8P培养基 它是1974年为原生质体培养而设
32、计的。其特点是有机成分较复杂，它包括了所有已知的单糖和维生素，广泛用于原生质融合的培养。,3、培养基的成分,培养基的成分主要有水、无机盐、有机物、天然复合物、激素、培养体的支持材料等。,水是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒。它是生命活动过程中不可缺少的物质。配制培养基母液时要用蒸馏水，以保持母液及培养基成分的精确性。大规模生产时，在不影响培养效果时可用自来水。但在少量研究上尽量用蒸馏水，以防成分的变化引起不良效果。,无机元素(inorganic element),大量元素，指浓度大于0.5mmolL的元素等。(1)N 是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的组成
33、成分，是生命不可缺少的物质。在制备培养基时以NO3N和NH4N两种形式供应。大多数培养基既含有NO3N又含NH4N。供应的物质有KNO3、NH4NO3等，NH4N更利于植物利用。有时，也添加氨基酸来补充氮素。,(2)P 是磷脂的主要成分。而磷脂又是原生质、细胞核的重要组成部分。磷也是ATP、DNA等的组成成分。在植物组织培养过程中，向培养基内添加磷，不仅增加养分、提供能量，而且也促进对N的吸收，增加蛋白质在植物体中的积累。常用的物质有KH2P04或NaH2P04等。,(3)K 与碳水化合物合成、转移、以及氮素代谢等有密切关系。K含量增加时，蛋白质合成增加，维管束、纤维组织发达，对胚的分化有促进
34、作用。但浓度不易过大，一般为13mgL为好。制备培养基时，常以KCI、KN03等盐类提供。,(4)Mg、S和CaMg 是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂；S是含S氨基酸和蛋白质的组成成分。它们常以MgSO4提供。用量为13mg L较为适宜；Ca是构成细胞壁的成分，Ca对细胞分裂、保护质膜不受破坏有显著作用，常以CaCl2提供。,微量元素 指小于0.5mmolL的元素，Fe，B，Mn，Cu，Mo，Co等。铁是一些氧化酶、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶等的组成成分。同时，它又是叶绿素形成的必要条件。培养基中的铁对胚的形成、芽的分化和幼苗转绿有促进作用。在制做培养基时不用FeSO4和FeCl3(因其在
35、pH值5.2以上，易形成Fe(OH)3的不溶性沉淀)，而用FeSO47H20和Na2-EDTA结合成螯合物使用。,B，Mn，Zn，Cu，Mo，Co等，也是植物组织培养中不可缺少的元素，缺少这些物质会导致生长、发育异常现象。,有机化合物(organic compound),培养基中若只含有大量元素与微量元素，常称为基本培养基（basic medium)。为不同的培养目的往往要加入一些有机物以利于快速生长。常加入的有机成分主要有以下几类：,碳水化合物 最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是较好的碳源，可支持许多组织很好的生长。麦芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在组织培养中也有应用。蔗糖使用浓度在2%3%，
36、常用3%，即配制一升培养基称取30g蔗糖，有时可用2.5%，但在胚培养时采用4%-15%的高浓度，因蔗糖对胚状体的发育起重要作用。,不同糖类对生长的影响不同。从各种糖对水稻根培养的影响来看，以葡萄糖效果最好，果糖和蔗糖相当，麦芽糖差一些。不同植物不同组织的糖类需要量也不同，实验时要根据配方规定按量称取，不能任意取量。高压灭菌时，一部分糖会发生分解，制定配方时要给予考虑。在大规模生产时，蔗糖可用食用的白糖代替。,维生素(vitamin)这类化合物在植物细胞里主要是以各种辅酶的形式参与多种代谢活动，对生长、分化等有很好的促进作用。虽然大多数的植物细胞在培养中都能合成所必需的维生素，但在数量上，还明
37、显不足，通常需加入一至数种维生素，以便获得最良好的生长。,主要有VBl(盐酸硫胺素)、VB6(盐酸吡哆醇)、Vpp(烟酸)、Vc（抗坏血酸）、有时还使用生物素、叶酸、VB12等。一般用量为0.11.0mgL。有时用量较高。VB1对愈伤组织的产生和生活力有重要作用，VB6能促进根的生长，Vpp与植物代谢和胚的发育有一定关系。Vc有防止组织变褐的作用。,肌醇(myoinosltol)又叫环己六醇，在糖类的相互转化中起重要作用。通常可由磷酸葡萄糖转化而成，还可进一步生成果胶物质，用于构建细胞壁。适当使用肌醇，能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成。对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用，对细胞壁的形成
38、也有作用。,氨基酸(almino acide)是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用。培养基中最常用的氨基酸是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等也常用。有时应用水解乳蛋白或水解酪蛋白，它们是牛乳用酶法等加工的水解产物，是含有约20种氨基酸的混合物，用量在10-1000mgL之间。由于它们营养丰富，极易引起污染，因此如在培养中无特别需要，以不用为宜。,天然复合物,其成分比较复杂，大多含氨基酸、激素、酶等一些复杂化合物，对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用。天然复合物的成分大多不清楚，所以一般应尽量避免使用。,椰乳 是椰子的液体胚乳。它是使用最多、效果最大的一
39、种天然复合物。一般使用浓度在10%20%，与其果实成熟度及产地关系也很大。香蕉 用量为150-200mlL。用黄熟的小香蕉，加入培养基后变为紫色。对pH值的缓冲作用大。主要在兰花的组织培养中应用。,马铃薯 去掉皮和芽后，加水煮30min，再经过过滤，取其滤液使用。用量为150200gL。水解酪蛋白 为蛋白质的水解物，主要成分为氨基酸，使用浓度为100200mgL。受酸和酶的作用易分解，使用时要注意。其他 酵母提取液(YE)(0.01%-0.05%)、麦芽提取液(0.01%0.5%)、苹果和番茄的果汁、黄瓜的果实、未熟玉米的胚乳等。遇热较稳定，大多在培养困难时使用，有时有效。,植物生长调节物,植
40、物激素是植物新陈代谢中产生的天然化合物，它能以极微小的量影响到植物的细胞分化、分裂、发育，影响到植物的形态建成、开花、结实、成熟、脱落、衰老和休眠以及萌发等许许多多的生理生化活动，在培养基的各成分中，植物生长调节物是培养基的关键物质，对植物组织培养起着决定性作用。,生长素类(auxin)在组织培养中，生长素主要被用于诱导愈伤组织形成，诱导根的分化和促进细胞分裂、伸长生长。在促进生长方面，根对生长素最敏感。在极低的浓度下，(10-5-10-8mgL)就可促进生长，其次是茎和芽。天然的生长素热稳定性差，高温高压或受光条件易被破坏。在植物体内也易受到体内酶的分解。组织培养中常用人工合成的生长素类物质
41、。,（1）IAA(indo acetic acid吲哚乙酸)是天然存在的生长素，亦可人工合成，其活力较低，是生长素中活力最弱的激素，高温高压易被破坏，也易被细胞中的IAA分解酶降解，受光也易分解。（2）NAA(naphthalene acetic acid萘乙酸)在组织培养中的起动能力要比IAA高出3-4倍，且由于可大批量人工合成，耐高温高压，不易被分解破坏，所以应用较普遍。NAA和IBA（吲哚丁酸）广泛用于生根，并与细胞分裂素互作促进芽的增殖和生长。,（3）IBA(indolebutyri acid吲哚丁酸)是促进发根能力较强的生长调节物质。（4）2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)起动能力比
42、IAA高10倍，特别在促进愈伤组织的形成上活力最高，但它强烈抑制芽的形成，影响器官的发育。适宜的用量范围较狭窄，过量常有毒效应。,细胞分裂素类(cytokinin)这类激素是腺嘌吟的衍生物，能促进胞质分裂和组织的分化、生长，与植物生长素有协同作用。包括6-BA(6-苄基氨基嘌呤)、Kt(kinetin 激动素)、Zt(zeatin 玉米素)等。其中Zt活性最强，但非常昂贵，常用的是6-BA。在培养基中添加细胞分裂素有三个作用：诱导芽的分化促进侧芽萌发生长。促进细胞分裂与扩大。抑制根的分化。因此，细胞分裂素多用于诱导不定芽的分化和茎、苗的增殖，而在生根培养时使用较少或用量较低。,GA(gibbe
43、rellic acid赤霉素)有20多种，生理活性及作用的种类、部位、效应等各有不同、培养基中添加的是GA3，主要用于促进幼苗茎的伸长生长，促进胚状体发育成小植株；赤霉素和生长素协同作用，对形成层的分化有影响，当生长素赤霉素比值高时有利于木质部分化，比值低时有利于韧皮部分化；此外，赤霉素还用于打破休眠，促进种子、块茎、鳞茎等提前萌发。一般在器官形成后，添加赤霉素可促进器官或胚状体的生长。,激素配比模式,生长素与细胞分裂素的比例决定着发育的方向，是形成愈伤组织、长根还是长芽。如为了促进芽器官的分化，应除去或降低生长素的浓度，或者调整培养基中生长素与细胞分裂素的比例。高 有利于根的形成和愈伤组织的
44、形成生长素/细胞分裂素 适中 有利于根芽的分化 低 有利于芽的形成生长调节物质的使用甚微，一般用mgL表示浓度。在组织培养中生长调节物质的使用浓度，因植物的种类、部位、时期、内源激素等的不同而异，一般生长素浓度的使用为0.05-5mgL，细胞分裂素0.05-10mgL。,Growth medium is optimised for regeneration of plantlets,No sucrose(0%),Sucrose reduced to 1%,Sucrose increased to 5%,The explant is completely covered with green s
45、hoots,and roots are developing on the lower surface,Very few shoots have developed on the explant.No roots and no callus.,Shoots developed on edges of upper surface,and some root development has occured,Shoots have developed over the surface of the explant,along with roots from the lower surface.The
46、 result is comparable with the control medium,tissue culture in the African Violet,No BAP,BAP reduced to 0.1 mg.l-1,No NAA,Poor shoot development and no roots.Extensive callus generation,Poor shoot development and no roots,NAA increased to 0.1 mg.l-1,More balanced development of roots and shoots.How
47、ever,undifferentiated callus is developing at the edges of the explant,Profuse development of roots and a reduced number of shoots.Undifferentiated callus is developing at the edges of the explant,NAA increased to 5.0 mg.l-1Profuse development of roots over the explant upper and lower surface,and fe
48、w shoots.Some callus,No MS saltsNo sign of regeneration from explant at all.,MS salts increased to 0.47 g.l-1 Some root growth but reduced development of shoots,MS salts increased to 9.52 g.l-1 Shoots developed on upper surface of explant.No roots or callus.,培养材料的支持物,琼脂(agar)在固体培养时琼脂是最好的固化剂。琼脂是一种由海藻
49、中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何营养。琼脂能溶解在热水中，成为溶胶，冷却至40即凝固为固体状凝胶。通常所说的“煮化”培养基，就是使琼脂溶解于90以上的热水。琼脂的用量在6-10gL之间，若浓度太高，培养基就会变得很硬，营养物质难以扩散到培养的组织中去。若浓度过低，凝固性不好。新买来的琼脂最好先试一下它的凝固力。一般琼脂以颜色浅、透明度好、洁净的为上品。琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工方式有关外，还与高压灭菌时的温度、时间、pH值等因素有关，长时间的高温会使凝固能力下降，过酸过碱加之高温会使琼脂发生水解，丧失凝固能力。时间过久，琼脂变褐，也会逐渐丧失凝固能力。,加入琼脂的固体培养基与
50、液体培养基相比优点在于操作简便，通气问题易于解决，便于经常观察研究等，但它也有不少缺点，如培养物与培养基的接触(即吸收)面积小，各种养分在琼脂中扩散较慢，影响养分的充分利用，同时培养物排出的一些代谢废物，聚集在吸收表面，对组织产生毒害作用。市售的各种琼脂几乎都含有杂质，特别是Ca、Mg及其他微量元素。因此在研究植物组织或细胞的营养问题时，则应避免使用琼脂。可在液体培养基表面安放一个无菌滤纸制成的滤纸桥，然后在滤纸桥上进行愈伤组织培养。其他 有玻璃纤维、滤纸桥、海绵、脱脂棉、卡拉胶等，总的要求是析出的有害物质对培养材料没有影响或影响较小。,玻璃纤维,抗生物质(antibiotic),抗生物质有青
