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1、第4节：免疫学方法及其应用,传统的免疫学方法仅局限于用体液免疫产生的抗体与各种抗原在体外进行反应，因所用抗体均采用自免疫后的血清，帮故称作血清学反应（serological reaction）。现代免疫学方法既包括体液免疫，又包括细胞免疫的各种方法，并发展出免疫诊断学（immunodiagnostics）和免疫学检测等分支技术学科，它们在疾病诊断、法医和基础理论等的研究和应用中，都有重要的作用。本节拟介绍一些重要的血清学反应和免疫标记技术及其应用,一、抗原、抗体反应的一般规律,（1）特异性抗原决定簇和抗体分子V区间的各种分子引力是它们间特异性的物质基础。这种高度特异性是各种血清学反应及其应用的
2、理论依据。（2）可逆性抗原抗体间的结合仅是一种物理结合，故在一定条件下是可逆的。（3）定比性抗原物质表面的抗原决定簇数目一般较多，故属多价的，而抗体一般仅以Ig单体形式存在，故是双价的。所以，只有当两者比例合适时，才会出现可见反应。（4）阶段性抗原与抗体的反应一般有两个明显的阶段，第一阶段的特点是时间短（一般仅数秒），不可见，第二阶段的时间长（从数分钟至数小时或数天），可见。第二阶段的出现受多种因子影响，如抗原抗体的比例、pH、温度、电解质和补体等。两个阶段间并无严格的界限。（5）条件依赖性最佳条件一般为pH68，温度为3745，适当振荡，以及用生理盐水作电解质等。,二、抗原、抗体间的主要反应
3、,(一)凝集反应(二)沉淀反应（precipitation）（三）补体结合试验（complement fixation test，CFT）（四）中和试验（neutralzation test）,(一)凝集反应（agglutination）,颗粒性抗原(细菌、血细胞等)与相应抗体在适量电解质环境中相互作用，经过一定时间出现肉眼可见凝集现象，称凝集反应或直接凝集反应(direct agglutination)，用于此反应中的抗原又称凝集原（agglutinogen），抗体则称凝集素(agglutinin)。间接凝集反应(indirect agglutination)。如ABO血型鉴定，即是用已知抗
4、血型抗体对待鉴定红细胞表面的血型抗原进行的定性玻片凝集反应。用已知病原体测病人体内有无相应抗体(定性)，以肉眼可见凝集的血清最高稀释度倍数作为血清效价(定量)，则可辅助传染病的诊断。如用于诊断伤寒的试管定量凝集试验称为肥达氏试验。,(二)沉淀反应（precipitation）,当可溶性抗原(蛋白质、多糖、类脂、血清、各种微生物培养液等)与相应抗体在电解质存在的适当条件下相遇，经过一定时间出现肉眼可见的沉淀现象，称沉淀反应,用于此反应中的抗原又称沉淀原（precipitonogen），抗体则称沉淀素(precipitin)。当反应于试管内进行时，称环状沉淀实验（ring precipitatio
5、n）。可溶性抗原与抗体在含电解质的凝胶介质(通常用半固体琼脂，起支持作用)内自由扩散，当相对应的抗原抗体相遇时，若比例适当可出现白色沉淀线，称琼脂扩散试验（agar diffusion test）。若使抗原抗体的移动在电场中进行，可以缩短反应时间提高灵敏度，是琼脂扩散与电泳技术的结合，称免疫电泳（immuno-electrophoresis）。可用于测定血清成分(如Ig，补体C3)的含量，鉴定提取物的纯度等。,（三）补体结合试验（complement fixation test，CFT）,补体结合试验是一种有补体参与，并以绵羊红细胞和溶血素（红细胞的特异抗体）是否发生溶血反应作指示的一种高灵敏
6、度的抗原与抗体结合反应。其中共有2个系统和5种成分参与反应,（三）补体结合试验（complement fixation test，CFT）,本反应的基本原理有两条：补体可与任何抗原和抗体的复合物相结合；指示系统如遇还未被抗原和抗体复合物所结合的游离补体，就会出现肉眼易见的溶血反应。本试验的优点：既可测未知抗体，也可测未各抗原；既适合作沉淀反应，也适合作凝集反应；尤其适宜检出微量抗原与抗体间出现的肉眼看不见的反应，因此可提高一般血清学反应的灵敏度。其缺点是操作复杂、影响因素较多。,（四）中和试验（neutralzation test）,由特异性抗体抑制相应抗原的生物学活性的反应，称为中和试验。属
7、于本试验中有生物学活性的抗原包括细菌外毒素的毒性、酶的催化活性和病毒的感染性等。在临床诊断中，测定风湿病患者体内是否存在抗链球菌O抗体的反应，就是利用中和试验来进行的。,三、免疫标记技术,某些小分子物质结合到抗原或抗体上，不影响抗原抗体反应但使之更容易观察从而提高检测的灵敏度，称为免疫标记技术。与抗原或抗体结合的小分子物质称为标记剂。近年免疫标记技术发展很快，各类物质被试用作标记物，其中以荧光素、放射性同位素和酶标记最为成熟，合称三大标记技术。,(一)免疫荧光技术(immunofluorescence technic),免疫荧光技术是一种将免疫反应的特异性与荧光标记分子的可见性结合起来的方法，
8、因常用荧光物质标记抗体，又称荧光抗体法（fluorescent antibody technique，FAT）。在一定条件下，用化学方法将荧光物质(荧光素)与抗体结合，但不影响抗体与抗原结合的活性，与相应抗原结合后，在荧光显微镜下观察抗原的存在与部位，可定位，亦可用荧光计定量。常用荧光素有异硫氰酸荧光黄(fluorescein isothiocyante,FITC)、罗丹明(lissamine rhodamine B,RB200)等。由于本法可在亚细胞水平上直接观察鉴定抗原，除用于疾病的快速诊断外，也广泛用于各类生物学研究,(二)免疫酶技术(immunoenzyme technic),免疫酶技
9、术又称酶免疫测定法（enzyme immunoassay），其原理是利用酶与抗原或抗体结合后，既不改变抗原或抗体的免疫学反应特异性，也不影响酶本身的活性，在特异抗原抗体反应后，在相应而合适的酶底物作用下，产生可见的不溶性有色产物。常用的为辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)，其次有碱性磷酸酶等。免疫酶技术可用于组织切片、细胞培养标本等组织细胞抗原的定性定位。也可用于可溶性抗原或抗体的测定，称酶联免疫吸附测定法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)。ELISA方法是将可溶性抗体或抗原吸附到聚苯乙烯等固相载体上，再进行免疫酶反应，用分光光度计比色以定性或定量，是目前应用最广泛的生物学技术之一。,(三)放射免疫测定法(radioimmunoassay,RIA),放射免疫测定法是一类以放射线同位素作为标记物，将同位素分析的灵敏性和抗原抗体反应的特异性这两大特点结合起来的测定技术。又分为放射免疫分析法和放射免疫测定自显影法。放射免疫技术灵敏度极高，能测得毫微克至微微克(10-910-12克)的含量，广泛用于激素、核酸、病毒抗原、肿瘤抗原等微量物质测定。但需特殊仪器及防护措施，并受同位素半衰期的限制。,The end,
