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1、细胞培养基本技术,徐州医学院神经生物研究中心 王婷,细胞培养的基本概念,体外培养细胞培养：使用单个细胞悬液组织培养：使用组织块（0.51立方毫米）或薄片（厚0.2 毫米）器官培养：使用器官原基或器官的一部分或整个器 官,培养细胞的生命归宿,原代培养期传代期衰退期,培养细胞的特性,培养细胞的生长方式贴附生长：必须贴附于支持物表面才能生长。悬浮生长：于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。,每代贴附生长细胞的生长过程,游离期贴壁期潜伏期对数生长期停止期（平台期）,游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮状态。也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。10分钟一4小时,贴壁期：细胞附着于底物上，游离
2、期 结束。细胞株平均在10分钟-4小时贴壁。底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等 血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子附着。进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）,潜伏期 此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为624 小时。,对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。,停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂 机制：接触抑制、密度依赖性,培养细胞生长的条件,1.细胞的营养需要2.细胞的生存环境 温度:37 O2 CO2:5%
3、CO2+H2O H2CO3 H+HCO3-渗透压 3.无污染 4.无毒,实验准备,实验用品：仪器：超净工作台 压力蒸汽消毒器 电热干燥箱 CO2培养箱 倒置显微镜 自动双重纯水蒸馏器 纯水仪 离心机 天平 水浴箱 液氮罐 冰箱 酸度计 滤器 酸缸 耗材：培养瓶 吸管 电动吸引器 培养板 冻存管等,超净台,超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气通过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。,滤 器,CO2培养箱,CO2培养箱设定的条件为37，5CO2。使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。保
4、持培养箱内空气干净。定期消毒（75%酒精擦拭)。箱内放置蒸馏水于蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避免培养液蒸发。,自动双重纯水蒸馏器 纯水仪,培 养 板,培养瓶,清洗与消毒,清洗玻璃器皿：新：浸泡 刷洗 浸酸 冲洗 旧：用后立即浸入水中，及时冲洗。胶塞：2%NaOH煮沸10-20 min 冲洗 1%稀盐酸30min 冲洗塑料器皿：2%NaOH浸泡过夜 冲洗 5%稀盐酸30min 冲洗包装：牛皮纸、棉布、铝饭盒,消毒紫外线消毒:湿热消毒(高压蒸汽消毒):滤过消毒:大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采化学消毒:新洁尔灭、75酒精,细胞培养用液及配制水：新鲜配置的双蒸水或去离子水平衡盐溶液：
5、无Ca2+、Mg2+的缓冲液 PBS：NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至1000 ml,消化液：1.胰蛋白酶 胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制。用滤器过滤除菌。2.EDTA 化学螯合剂 对细胞有一定离解作用 3.胶原酶 消化作用温和，对细胞损伤小。,培养基,培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。天然培养基：天然培养基有血清、血浆、组织提取液（如鸡胚和牛
6、胚浸液）。优点：营养成分丰富，培养效果好缺点：来源受限 成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析 易发生支原体污染,合成培养基,合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如M199、MEM、RPMI-1640、DMEM、F12等。合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。优点：标准化生产，组分和含量相对固定，成本低。缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。,血清中含有：多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋
7、白等）多种金属离子激素 促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等各种生长因子转移蛋白不明成分,对于血清支持细胞生长的生物学效应已得到证明，但对血清中的复杂成分至今尚未完全清楚血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制因子或毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研究领域，迫切需要用无血清培养基培养细胞无血清培养基的主要研制策略：在基础培养基中补充各种必需因子，如激素、生长因子、结合蛋白、贴壁和扩展因子 等。无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分组成。,无血清培养基尚处于研究阶段，难以推广。
8、目前，绝大多数人工合成培养基使用时还需添加血清。一般说来含5血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死但支持细胞生长一般需加 10血清 血清质量好坏是实验成败的关键。常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。血清的灭活（消除补体活性）：56，30 分钟,培养基的配制,RPMI-1640培养粉 1袋 碳酸氢钠 2.0 g 青、链霉素 各100单位毫升 加双蒸水 至 1000ml,过滤除菌。调节pH值至7.2 加血清（终浓度 10）,培养操作基本要领和要求,培养前准备：对初学者宜制定操作卡片操
9、作野消毒：多用紫外灯洗手与着装：原则上与外科手术相同火焰消毒：启开或封闭瓶口等应烧灼 注意：金属器械烧后需冷却，吸过营养液的吸管不宜烧灼操作：台面上合理布局，操作准、稳、快,原代培养细胞操作流程,过滤 计数取材 剪碎 消化 离心 接种 选择消化液 选择瓶或板低温、快 轻、快 控制时间 控制转速 控制密度 温度 时间 PH 浓度,细胞传代方法,根据细胞生长的恃点，传代方法有3种。1.悬浮生长细胞传代（干细胞）离心法传代：离心（1000rpm）去上清，加新培养液后再混匀传代。直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l2一23，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。2.半悬浮生长细胞传代（
10、Hela细胞）此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使 细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。3.贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。,贴壁生长细胞传代方法：,1.吸除培养瓶中的培养液2.加入1-2 ml 0.25的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准）静置（显微镜下动态监测）。3.吸去胰蛋白酶液，加入含血清的培养液。4.用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。5.计数，接种于新的培养瓶内。,细胞计数,血细胞计数板：将计数板和一张盖玻片擦拭干净，把盖玻片覆在计数板上面，使之稍微移向一侧，露出部分计数板台面，以便滴加细胞悬液。染色：取
11、细胞悬液9滴，台盼蓝1滴，混匀。加悬液：把计数板平放在显微镜台上，立即从计数板边缘轻轻滴1滴已染色的细胞悬液。镜下观察（如图）细胞数/ml 原悬液4大格细胞总数/4*10000*稀释倍数,细胞计数,细胞冻存和复苏,细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少人力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。,冻存和复苏的原则：慢冻快融,当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形
12、成大冰晶，即冰晶的重结晶。,慢冻程序,标准程序：当温度在-25 以上时，12/min 当温度达-25 以下时，510/min 当温度达-100时，可迅速放入液氮中 细胞冻存器简易程序：将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，-20 1h,通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，6h，直接投人液氮中。,细胞冻存方法,1.预先配制冻存液：含20%血清培养基 10%DMSO 2.取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液,用吸管吹打制成细胞悬液（1106 5 106细胞/ml)3.加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。,细胞复苏方法,（l）从液氮中取出冷冻管，迅速投入
13、3738 水浴中，使其融化（1分钟左右）。（2）5分钟内用培养液稀释至原体积的5倍以上。（3）低速离心10分钟。（4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。,细胞培养的污染,微生物真菌、细菌、支原体和病毒化学物影响细胞生存的非细胞所需成分细胞非同种的其他细胞来源：不洁的动物组织标本 空气 清洗与消毒 操作 血清,细胞培养污染的鉴别,1.细菌、真菌污染的检测（1）肉眼观察 细菌、真菌污染常在传代、换液、加样等开放性操作后发生，而且增生迅速，若有污染，在48小时内可明显观察到。如培养液变混浊，或略加振荡有很多漂浮物漂起。（2）镜下观察 在倒置显微镜的高倍镜下可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮，即为细菌污染。若细胞之间有丝状、管状、树枝状或卵形的物质为真菌污染。（3）接种观察,2.支原体污染的检测（1）相差显微镜观察 用相差油镜观察，支原体呈暗色微小颗粒，多位于细胞与细胞之间，有时可见类似于布朗运动的表现。应注意于细胞破碎溢出的内容物如线粒体等相区别。（2）低涨处理地衣红染色观察（3）荧光染色法观察（4）电镜检测（5）培养检测,细胞培养污染的预防控制,预防1.消毒、灭菌2.规范操作3.防止细胞交叉污染清除1.使用抗生素2.加温处理3.使用支原体特异性血清,
