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1、第一节、毛细管色谱,第二章 色谱法的新技术,1.毛细管色谱柱的结构特点,（1）不装填料阻力小，长度可达百米的毛细管柱，管径0.2mm。（2）气流单途径通过柱子，消除了组分在柱中的涡流扩散。（3）固定液直接涂在管壁上，总柱内壁面积较大,涂层很薄，则气相和液相传质阻力大大降低。（4）毛细管色谱柱柱效高达每米30004000块理论塔板，一支长度100米的毛细管柱，总的理论塔板数可达104106。,2.毛细管色谱分离能力提高的途径(1)由塔板理论：增加柱长减小柱径，即增加柱子 塔板数；(2)由速率理论：减小组分在柱中的涡流扩散 和传质阻力，也即降低塔板高度,3.毛细管色谱具有的优点,（1）分离效率高：
2、比填充柱高10100倍；（2）分析速度快：用毛细管色谱分析比用填充柱色谱速度（3）色谱峰窄、峰形对称。（4）灵敏度高，一般采用氢焰检测器。（5）涡流扩散为零。,4.毛细管色谱的 种类与制备方法,毛细管柱按其制备方法可分为以下几种：涂壁开管柱（wall coated opentubular，WCOT柱）：将固定液直接涂敷在管内壁上。柱制作相对简单，但柱制备的重现性差、寿命短。多孔层开管柱（porous layer open tubular，PLOT柱）：在管壁上涂敷一层多孔性吸附剂固体微粒。构成毛细管气固色谱。载体涂渍开管柱（support coated open tubular，SCOT柱）：
3、将非常细的担体微粒粘接在管壁上，再涂固定液。柱效较WCOT柱高。化学键合或交联柱：将固定液通过化学反应键合在管壁上或交联在一起。使柱效和柱寿命进一步提高。,5.毛细管色谱实验技术,毛细管柱内径很细，因而带来三个问题：（1）允许通过的载气流量很小。（2）柱容量很小，允许的进样量小。需采用分流技术，（3）分流后，柱后流出的试样组分量少、流速慢。解决方法：灵敏度高的氢焰检测器，采用尾吹技术。,分流比：放空的试样量与进入毛细管柱的试样量之比。一般在50：1到500：1之间调节。,1.基本原理及方法,基本原理：在一定条件下，高分子及非挥发性有机化合物遵循一定的裂解规律，即特定的样品能够产生特征的裂解产物
4、及产物分布，采用气相色谱分析、鉴定裂解产物，据此可对原样品进行表征。方法：样品置于裂解器中，在严格控制的条件下，快速加热，使之迅速分解成为可挥发的小分子产物，然后直接将裂解产物送入色谱柱中进行分离，获得定性定量数据。,第二节、裂解气相色谱的原理与应用,特点:,(1)分离效率高(色谱法自身的特点)(2)灵敏度高(色谱法自身的特点)(3)分析速度快 快速裂解、快速分析；不丢失信息；(4)信息量大 裂解条件与裂解产物关系；样品组成与裂解产物；裂解机理和反应动力学研究(5)适合于各种形态样品 粘稠液体、粉末、纤维及弹性体、固化树脂、涂料 硫化橡胶、塑料等；(6)简单、易行,2.流程,3.对裂解器的要求
5、,(1)裂解反应控制 裂解温度的精确控制(裂解温度不同，裂解产物不同)；可重复进行；(2)裂解温度范围可调 不同物质需要不同的裂解温度；400-1500 C(3)裂解器与接口的体积小 减小死体积；防止色谱峰变宽；(4)对裂解反应无催化反应 防止歧化反应和二次反应；,4.裂解器,(1)管式炉裂解器 外壁加热的圆管，简单，易于控制。死体积大，二次反应突出；(2)热丝裂解器 样品放置在加热丝的螺旋管中；(3)居里点裂解器 利用电磁感应加热；铁磁性材料置于高频电场中，吸收射频能量迅速升温，达到居里点温度时，变为顺磁质，不再吸收能量，温度稳定在该点；样品放置在铁磁性材料制成的加热元件上。不同组成的铁磁质
6、合金具有不同居里点温度；(3)激光裂解器,第三节、顶空气相色谱的技术与应用,对液体或固体试样中的挥发性成分进行气相色谱分析的技术；试样置于密闭的恒温系统中，气-液（气-固）两相达到热力学平衡时，测定气相组成。,两种方式：静态法：恒温密闭系统，平衡时，测定气相组成；动态法：吹扫-捕集法，采用吸附剂吸附，加热解吸。,理论依据,当顶空瓶中样品上面的蒸气压相当低时，峰面积Ai的大小与样品上面的气相中挥发性组分 i 的蒸气压pi成正比 Ai=fi pifi为校正因子，在真实体系中，蒸气分压通常用下式表示：pi=poiixi poi为气相中组分i 的摩尔分数；xi为样品中组分i 的摩尔分数；i为组分i 的
7、活度系数。Ai=fi pi=fiixi poi当系统平衡时：Ai=fi pi=ki xi 通过顶空分析，可确定试样中的含量。,一、概述,质谱：纯物质结构分析色谱：化合物分离色谱-质谱联用：共同优点GC-MS；LC-MS；CZE-MS（毛细管电泳-质谱）困难点：载气(或流动液)的分离；出峰时间监测；仪器小型化；关键点：接口技术(分子分离器),第四节 色谱质谱联用仪,GC-MS中的分子分离器,分子分离器类型：微孔玻璃式、半透膜式和喷射式三种。喷射式分子分离器：由一对同轴收缩型喷嘴构成，喷嘴被封在一真空室中，如图所示。可做成多级。,四极杆质量分析器￥,三、LC-MS联用仪器,1.大气压电离技术（AP
8、I）（1）电喷雾电离（API Electrospray）不适用于非极性化合物,（2）大气压化学电离,热喷雾(100-120C)，化学电离;适用于热稳定化合物分析,电喷雾电离,流出液在高电场下形成带电喷雾，在电场力作用下穿过气帘；气帘的作用：雾化；蒸发溶剂；阻止中性溶剂分子,2.离子阱质量分析器,特定m/z离子在阱内一定轨道上稳定旋转，改变端电极电压，不同m/z离子飞出阱到达检测器；&,在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象，称之为电泳。由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率不同可实现分离。,1.经典电泳分离法的不足 所用分离柱
9、的柱径大，柱较短，分离效率不高（远低于HPLC），温度影响大。高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进。,第五节 高效毛细管电泳色谱,一、高效毛细管电泳(HPCE)基本原理,2.高效毛细管电泳技术上的重要突破,高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进：一是采用了0.05mm内径的毛细管,；二是采用了高达数千伏的电压。毛细管的采用使产生的热量能够较快散发，大大减小了温度效应，使电场电压可以很高。电压升高，电场推动力大，又可进一步使柱径变小，柱长增加，高效毛细管电泳的柱效远高于高效液相色谱，理论塔板数高达几十万块/米，特殊柱子可以达到数百万。,3.高效毛细管电泳(HPCE)基本原理,电泳是指带电离
10、子在电场中的定向移动，不同离子具有不同的迁移速度，迁移速度与哪些因素有关？当带电离子以速度 在电场中移动时，受到大小相等、方向相反的电场推动力和平动摩擦阻力的作用。,电场力：FE=qE 阻 力：F=f故：qE=fq离子所带的有效电荷；E 电场强度；离子在电场中的迁移速度；f 平动摩擦系数(对于球形离子：f=6；离子的表观液态动力学半径；介质的粘度；),所以，迁移速度：,（球形离子）,物质离子在电场中差速迁移是电泳分离的基础。淌度：单位电场强度下的平均电泳速度。,二、电渗现象与电渗流,1.电渗流现象 当固体与液体接触时，固体表面由于某种原因带一种电荷，则因静电引力使其周围液体带有相反电荷，在液-
11、固界面形成双电层，二者之间存在电位差。,当液体两端施加电压时，就会发生液体相对于固体表面的移动，这种液体相对于固体表面的移动的现象叫电渗现象。电渗现象中整体移动着的液体叫电渗流（简称EOF）。,2.HPCE中的电渗现象与电渗流,石英毛细管柱，内充液pH3时，表面电离成-SiO-,管内壁带负电荷，形成双电层。,在高电场的作用下,带正电荷的溶液表面及扩散层向阴极移动，由于这些阳离子实际上是溶剂化的，故将引起柱中的溶液整体向负极移动，速度电渗流。,3.HPCE中电渗流的大小与方向,电渗流的大小用电渗流速度电渗流表示，取决于电渗淌度和电场强度E。即 电渗流=E电渗淌度取决于电泳介质及双电层的Zeta电
12、势，即=0/0-真空介电常数;-介电常数;-毛细管壁的Zeta电势。电渗流=0E/实际电泳分析，可在实验测定相应参数后，按下式计算 电渗流=Lef/teoLef-毛细管有效长度;teo-电渗流标记物（中性物质）的迁移时间。,HPCE中电渗流的方向,电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质：内表面带负电荷,溶液带正电荷,电渗流流向阴极；内表面带正电荷,溶液带负电荷,电渗流流向阳极；石英毛细管；带负电荷，电渗流流向阴极；改变电渗流方向的方法：（1）毛细管改性 表面键合阳离子基团；（2）加电渗流反转剂 内充液中加入大量的阳离子表面活性剂,将使石英毛细管壁带正电荷,溶液表面带负电荷.电渗流流向阳极.,
13、4.HPCE中电渗流的流形,电荷均匀分布，整体移动，电渗流的流动为平流，塞式流动（谱带展宽很小）；液相色谱中的溶液流动为层流，抛物线流型，管壁处流速为零，管中心处的速度为平均速度的2倍（引起谱带展宽较大）。,5.HPCE中电渗流的作用,电渗流的速度约等于一般离子电泳速度的57倍；各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为：+=电渗流+ef 阳离子运动方向与电渗流一致；-=电渗流-ef 阴离子运动方向与电渗流相反；0=电渗流 中性粒子运动方向与电渗流一致；（1）可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离；（2）改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性，这是HPCE中优化分离的重要因素；（3）电渗流的
14、微小变化影响结果的重现性；在HPCE中，控制电渗流非常重要。,三、HPCE中影响电渗流的因素,1.电场强度的影响 电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度一定时，电渗流速度正比于工作电压。,2.毛细管材料的影响 不同材料毛细管的表面电荷特性不同，产生的电渗流大小不同；,电渗流=0E/,3.电解质溶液性质的影响,（1）溶液pH的影响 对于石英毛细管，溶液pH增高时，表面电离多，电荷密度增加，管壁zeta电势增大，电渗流增大，pH=7，达到最大；pH3，完全被氢离子中和，表面电中性，电渗流为零。分析时，采用缓冲溶液来保持pH稳定。（2）阴离子的影响 在其他条件相同，浓度相同而阴离子不同时，毛细管中
15、的电流有较大差别，产生的焦耳热不同。,缓冲溶液离子强度，影响双电层的厚度、溶液黏度和工作电流，明显影响电渗流大小。缓冲溶液离子强度增加，电渗流下降。,4.温度的影响,毛细管内温度的升高，使溶液的黏度下降，电渗流增大。温度变化来自于“焦耳热”；焦耳热：毛细管溶液中有电流通过时，产生的热量；HPCE中的焦耳热与背景电解质的摩尔电导、浓度及电场强度成正比。温度每变化1度，将引起背景电解质溶液黏度变化2%3%；,5.添加剂的影响,（1）加入浓度较大的中性盐，如K2SO4，溶液离子强度增大，使溶液的黏度增大，电渗流减小。,（2）加入表面活性剂，可改变电渗流的大小和方向；加入不同阳离子表面活性剂来控制电渗
16、流。加入阴离子表面活性剂，如十二烷基硫酸钠（SDS），可以使壁表面负电荷增加，zeta电势增大，电渗流增大；（3）加入有机溶剂如甲醇、乙腈，使电渗流增大。,四、淌度 mobility,淌度：带电离子在单位电场下的迁移速度；淌度不同是电泳分离的基础。1.绝对淌度(absolute mobility)ab 无限稀释溶液中带电离子在单位电场强度下的平均迁移速度，简称淌度。可在手册中查阅。2.有效淌度(effective mobility)ef 实际溶液中的淌度(实验中测定的)。ef=aii ai-溶质i 的解离度;i-溶质i 在解离状态下的绝对淌度3.表观淌度 ap 离子在实际分离过程中的迁移速度（
17、表观迁移速度）：ap=ap E,五、HPCE中的参数与关系式,1.迁移时间（保留时间）HPCE兼具有电化学的特性和色谱分析的特性。有关色谱理论也适用。,V外加电压；L毛细管总长度；2.分离效率（塔板数）在HPCE中，仅存在纵向扩散，2=2Dt,扩散系数小的溶质比扩散系数大的分离效率高，分离生物大分子的依据。,N=5.54(tR/Y1/2)2,3.分离度,影响分离度的主要因素；工作电压V；毛细管有效长度与总长度比；有效淌度差。分离度可按谱图直接由下式计算：,六、影响分离效率的因素区带展宽,1.纵向扩散的影响 在HPCE中，纵向扩散引起的峰展宽：2=2Dt 由扩散系数和迁移时间决定。大分子的扩散系
18、数小，可获得更高的分离效率，大分子生物试样分离的依据。2.进样的影响 当进样塞长度太大时，引起的峰展宽大于纵向扩散。分离效率明显下降；理想情况下，进样塞长度：Winj=(24D t)1/2 实际操作时进样塞长度小于或等于毛细管总长度的1%2%。,3.焦耳热与温度梯度的影响,电泳过程产生的焦耳热可由下式计算：,m电解质溶液的摩尔电导；I工作电流：cb电解质浓度；散热过程中，在毛细管内形成温度梯度（中心温度高），破坏了塞流，导致区带展宽。改善方法：（1）减小毛细管内径；（2）控制散热；,4.溶质与管壁间的相互作用,存在吸附与疏水作用，造成谱带展宽；蛋白质、多肽带电荷数多，有较多的疏水基，吸附问题特
19、别严重，是目前分离分析该类物质的一大难题。细内径毛细管柱，一方面有利于散热，另一方面比表面积大，又增加了溶质吸附的机会。减小吸附的方法和途径：加入两性离子代替强电解质，两性离子一端带正电，另一端带负电，带正电一端与管壁负电中心作用，浓度约为溶质的100-1000倍时，抑制对蛋白质吸附，又不增加溶液电导，对电渗流影响不大。,5.其他影响因素,（1）电分散作用对谱带展宽的影响 当溶质区带与缓冲溶液区带的电导不同时，也造成谱带展宽；尽量选择与试样淌度相匹配的背景电解质溶液。（2）“层流”现象对谱带展宽的影响 一般情况下，HPCE中不存在层流，但当毛细管两端存在压力差时，出现抛物线形的层流；产生的原因
20、：毛细管两端液面高度不同。实际操作时，保持毛细管两端缓冲溶液平面高度相同。,1、仪器流程与主要部件,电压：030kV；分离柱不涂敷任何固定液；紫外或激光诱导荧光检测器；（可检测到：10-1910-21 mol/L）,七、高效毛细管电泳仪,1）高压电源,（1）030 kV 稳定、连续可调的直流电源；（2）具有恒压、恒流、恒功率输出；（3）电场强度程序控制系统；（4）电压稳定性：0.1%；（5）电源极性易转换；,2）毛细管柱（1）材料：石英：各项性能好；玻璃：光学、机械性能差；（2）规格：内径2075m，外径350400m；长度=1m,3）缓冲液池,化学惰性，机械稳定性好；4）检测器 要求：具有极
21、高灵敏度，可柱端检测；检测器、数据采集与计算机数据处理一体化；,类型 检测限/mol 特点紫外-可见 10-1310-15 加二极管阵列，光谱信息荧光 10-1510-17 灵敏度高，样品需衍生激光诱导荧光 10-1810-20 灵敏度极高，样品需衍生电导 10-1810-19 离子灵敏，需专用的装置；,2、毛细管电泳的进样方式,进样量：毛细管长度的1%-2%；纳升级、非常小；1）流体力学进样方式（1）进样端加压（2）出口端抽真空（3）虹吸进样,毛细管一端插入样品瓶，加电压；,2）电动进样方式,进样不均：电歧视现象，淌度大的离子比淌度小的进样量大；离子丢失：淌度大且与电渗流方向相反的离子可能进
22、不去；特别适合黏度大的试样；3）扩散进样 试样通过扩散作用进入分离柱端口处。,八、高效毛细管电泳分离模式,分离类型八种分离类型，介绍常用的几种；根据试样性质不同，采用不同的分离类型；每种机理的选择性不同；,1、毛细管区带电泳(CZE),带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流速度的矢量和。正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出 中性粒子：无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出；,阴离子：两种效应的运动方向相反；电渗流 电泳时,阴离子在负极最后流出,在这种情况下,不但可以按类分离,同种类离子由于差速迁移被相互分离。最基本、应用广的分离模式；,2、毛细管凝胶电泳(CGE),将聚丙烯酰胺等在毛细管
23、柱内交联生成凝胶。其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。蛋白质、DNA等的电荷/质量比与分子大小无关，CZE模式很难分离，采用CGE能获得良好分离，DAN排序的重要手段。特点：抗对流性好，散热性好，分离度极高。无胶筛分技术：采用低粘度的线性聚合物溶液代替高粘度交联聚丙烯酰胺。柱便宜、易制备。,1)缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度达到临界浓度，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。,3、胶束电动毛细管色谱（MECC，MEKC）,在电场力的作用下，胶束在柱中移动。,2)电泳流和电渗流的方向相反,且电渗流 电泳，负电胶束以较慢的速度向负
24、极移动；,5)色谱与电泳分离模式的结合。,3)中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长；4)可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围；,1)根据等电点差别分离生物大分子的高分辨率电泳技术；2)毛细管内充有两性电解质（合成的具有不同等电点范围的脂肪族多胺基多羧酸混合物），当施加直流电压（68V）时，管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的pH梯度；3)氨基酸、蛋白质、多肽等的所带电荷与溶液pH有关，在酸性溶液中带正电荷，反之带负电荷。在其等电点时，呈电中性，淌度为零；,4、毛细管等电聚焦,4)聚焦：具有不同等电点的生物试样在电场力的作用下迁移，分别到
25、达满足其等电点pH的位置时，呈电中性，停止移动，形成窄溶质带而相互分离；,5)阳极端装稀磷酸溶液，阴极端装稀NaOH溶液；6)加压将毛细管内分离后的溶液推出经过检测器检测；7)电渗流在CIEF中不利，应消除或减小。,1.将两种淌度差别很大的缓冲液分别作为前导离子(充满毛细管)和尾随离子，试样离子的淌度全部位于两者之间，并以同一速度移动。2.负离子分析时，前导电解质的淌度大于试样中所有负离子的。所有试样都按前导离子的速度等速向阳极前进，逐渐形成各自独立的区带而分离。阴极进样，阳极检测。,5、毛细管等速电泳,3.不同离子的淌度不同，所形成区带的电场强度不同(=E)，淌度大的离子区带电场强度小；沿出
26、口到进口，将不同区带依次排序1、2、3、4 电场强度依次增大。假设“2”号中离子扩散到“3”号，该区电场强度大，离子被加速，返回到“2”区；当“2”号中离子跑到“1”号区，离子被减速使之归队；4.特点：界面明显，富集、浓缩作用；,在毛细管壁上键合或涂渍高效液相色谱的固定液，以电渗流为流动相，试样组分在两相间的分配为分离机理的电动色谱过程；,6、毛细管电渗色谱,九、高效毛细管电泳应用与进展 1、离子分析,阳离子分析迁移方向和电渗流方向一致；4.5min内分离了24种金属离子；阳极进样，阴极检测；具有很高的灵敏度；,阴离子分析,阴离子电泳方向和电渗流方向相反、速度接近，分析时间长、效率低；质量小、
27、电荷密度大的离子如：SO4-2、Cl-、F-等，电泳速率大于电渗流，阳极端流出，在阴极端无法检测；加入电渗流改性剂，十六烷基三甲基溴化胺等，使电泳方向和电渗流方向一致，可在3.1min内分离36种阴离子；阴极进样，阳极检测；,2、药物分析,检测体液或细胞中某些代谢产物的分析；尿液中的氨基酸含量作为临床诊断糖尿病的辅助手段；采用毛细管区带电泳方式，在11min内分离17种药物；,采用MEKC模式，鉴定违禁药物；效果优于HPLG法,3、手性化合物分析,合成获得单一手性化合物相当困难；528种手性合成药物，61种以单一对映体形式销售，其他为外消旋体；检测分析也相当困难；研究热点；R-反应停是安眠药，
28、S-式致胎儿畸形；HPCE分离分析手性化合物的方法：加入手性选择剂；形成配合物的稳定常数有差异，结合HPCE的高效率；常用手性选择剂：环糊精及其衍生物；手性冠醚；手性表面活性剂（氨基酸衍生物、胆酸钠、牛磺脱氧胆酸及其钠盐、低聚糖等天然手性表面活性剂）,4、氨基酸与蛋白质分析,采用MEKC模式，在25分钟内分离了23种丹酰化氨基酸；HPCE可取代传统的氨基酸分析仪；问题：吸附和检测；,蛋白质分析,5、核酸分析及DNA排序,重要分析手段；图，酶解的双螺旋DNA限制性片段的分离；,6、新进展,1）微型化 整体化学分析系统（TAS）及TAS微型化 在硅片上光刻出矩形槽作为毛细管，理论塔板数105/m；2）联用仪器 CE-MS；3）阵列毛细管凝胶电泳 应用于人类基因DNA测序；,
