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1、,一教学内容,色谱分离的基本概念和基本原理色谱分离的理论基础简单的色谱定性和定量分析的方法,2.1 色谱法概述,2.1.1 色谱法的起源和发展,液液分配色谱,一、色谱法的定义,2.1.2 色谱法定义和分类,定义：利用不同溶质（样品）与固定相和流动相之间的作用力（分配、吸附、离子交换等）的差别，当两相做相对移动时，各溶质在两相间进行多次平衡，使各溶质达到相互分离。,特点：高超的分离能力，是一种物理化学分析方法,具体优点：,（1）分离效率高。（2）应用范围广。（3）分析速度快。（4）样品用量少。（5）灵敏度高。（6）分离和测定一次完成。（7）易于自动化，可在工业流程中使用。,定性能力较差。,色谱法
2、的缺点,二、色谱法的重要概念,固定相流动相色谱柱,1、按流动相所处的状态分类 气相色谱-用气体作流动相 液相色谱-用液体作流动相,三、色谱法的分类,超临界流体色谱,2、按固定相使用的形状分类,柱色谱：固定相装在柱管内。纸色谱薄层色谱(纸色谱和薄层色谱又统称作平板色谱),3、按分离过程的物理化学原理分类,吸附色谱(LS，GS)分配色谱(LL，GL)离子交换色谱(LS)空间排阻色谱(LS),吸附色谱(LS，GS),空间排阻色谱(LS),2.2 色谱分离原理,1.分配系数（K）,Cs：被测组分在固定相中的浓度Cm：被测组分在流动相中的浓度,2.2.1 分配系数和分配比,分配系数意义：,K是热力学常数
3、，K值除了与温度、压力有关外，还与被测物、固定相和流动相的性质有关。K值大Cs大tR长移动速度慢。若两组分的K值相等两个组分分离开。,2.分配比（k）,：相比,分配比的意义：k随K和的变化而变化；k值越大ms越多柱的容量大 k又称作容量因子。k是表征色谱柱对被测组分保留能力的主要参数。,2.2.2 色谱法分离原理,色谱分离过程的特点：不同组分在通过色谱柱时移动速度不等。,2.3 色谱流出曲线,五种磺胺的色谱图,气相色谱分离多环芳烃色谱图,一、色谱流出曲线或色谱图 以检测器对组分的响应信号为纵坐标，流出时间(或流出体积)为横坐标作图所得的曲线。Rf(t,V)二、色谱流出曲线构成：由基线和色谱峰组
4、成。基线：指仅有流动相通过而没有待测物，检测器响应信号随流出时间的变化。色谱峰：在基线上突起的部分，它是由引入流动相中被测物引起的。,色谱图或色谱流出曲线,描述色谱峰三种参数峰高(或峰面积)峰的大小区域宽度 峰的形状保留值(时间t、体积v)峰的位置,2.3.1 色谱峰,高斯分布曲线,1峰高h2标准偏差，0.607h处，拐点处，峰宽正好为23峰面积A A1.065hY1/24半峰宽Y1/2 Y1/2=2.3545峰底宽Y=4，拐点作切线与基线相交，相交两点间距离为峰底宽Y。Y1/2、Y统称为区域宽度,通常用将各组分带出色谱柱所需的载气体积或时间表示。,2.3.2 保留值,定义：,在一定的固定相和
5、操作条件下，任何一种物质都有一个固定的保留值，故组分的保留值可用于该组分的定性鉴定。,特点：,1死时间tM,说明：实际上就是流动相通过色谱柱所需要的时间。或是组分在流动相中所消耗的时间。tM由色谱柱中流动相体积Vm与流动相流速决定，与被测组分和固定相无关。,2.保留时间tR,定义：从进样开始到柱后,组分出现响应信号极大值 时所需时间。说明：组分的保留时间就是组分通过色谱柱所需的时间。即组分在色谱柱内运行的时间。影响因素：流 动 相性质、在色谱柱中的体积Vm和流速固 定 相性质、在色谱柱中的体积Vs；被测组分性质,3.调整保留时间（）,定义：扣除死时间后的保留时间。说明：组分在固定相中停留的时间
6、。,=,注意：,4.流动相的流速,定义：单位时间流动相所通过的距离-线流速，u单位时间通过流动相的体积-体积流速，F单位时间通过流动相的量-质量流速，Fm和摩尔流速，Fn)F、Fm和Fn常称作流量。,说明：在流路的任何一点，质量流速或摩尔流速相等。Fm=Fn 对于气相色谱，线流速和体积流速可能各处不同；对于液相色谱，线流速可能不一样，但体积流速可视为各处相同。,气体状态方程,不同位置处，线流速不同,气相色谱中柱内平均体积流速的确定,c点处的平均体积流速,为柱内气体的平均摩尔流速,为流量计内r处气体的摩尔流速,Fc很难测，且为柱内平均值，Fr易测，求Fr与Fc的关系即可。,柱内平均压力 Pc,r
7、点处载气的压力Pr,Pr=PoPw,5.死体积VM,定义：不被固定相保留的组分，通过色谱柱时所需流动相的体积。,计算：VM=tM,6.保留体积VR,定义：从进样开始到柱后出现待测组分响应信号极大值时所通过的载气体积。,计算：VR=tR,注意：各种保留时间受流动相流速的影响，各种保留体积与流动相流速无关。,7.调整保留体积,定义：保留体积扣除死体积后的体积,计算公式：=VR VM,计算公式：,8.相对保留值 r2,1（选择性因子）,定义：相对保留值 r2,1是指组分2的调整保留值与组分1的调整保留值之比,公式：,越大两组分容易分离；=1时两组分不能分开。说明：只与柱温和固定相性质有关,9.保留值
8、与分配比的关系,色谱柱长是一定的，所以,色谱过程方程：,表达了保留时间与分配系数或容量因子两个重要参数的关系。容量因子越大，溶质的保留时间也越长。对于混合物，分配系数不等是分离的前提。,例2.1 已知Vs=2.0 mL，Fc=50 mLmin-1，tR=5 min，tM=1 min。求VM，VR，k，K。,色谱流出曲线可以解决的问题,1样品所含最少组分个数 2可以进行定性分析3可以进行定量分析4可对色谱柱效能进行评价5.色谱过程的热力学问题6.色谱过程的动力学问题,总结,色谱理论,色谱理论需要解决的问题：影响分离及柱效的因素与提高柱效的途径，柱效与分离度的评价指标及其关系 色谱分离过程的热力学
9、和动力学问题。,2.4 塔板理论,2.4.1 塔板理论的假设,1.柱分成n段，n为理论塔板数，每段高为H，H为塔板高度，柱长为L，则n=L/H2.所有组分开始都加在第零号塔板上。3.在每块塔板上被测物在两相间平衡是瞬间建立的。4.流动相是以脉冲式(塞子式)进入色谱柱进行冲洗的，每次恰好为一个塔板体积V。5.在所有塔板上，同一组分的分配系数为常数，即和组分的量无关。6.沿色谱柱方向不存在塔板与塔板间被测物的纵向扩散。,假定：K=1 Vs/Vm=1 k=1 n=5 进样量 m=1mg,检测器,这一理论得到结果,1分布有一最大，两边逐渐减小2色谱流出曲线的形状类似于数学上的正态分布曲线,正态分布方程
10、为：,C：不同流出体积时的组分浓度m：进样量 VR：保留体积n：塔板数 V：流出体积,将正态分布方程用于色谱流出曲线方程的数学表达式，也称塔板理论方程：,令：为标准偏差,令：m=1,当VVR时，,当,则,则：,将,代入,由Y1/2=2.354 和 Y=4 可证明,Y1/2=0.5885Y,为了准确评价色谱柱效能，宜采用有效塔板数neff和有效塔板高度Heff,理论塔板数和有效塔板数关系,说明：对于n和neff以及H和Heff，用同一色谱柱时对不同物质是不一样的；同一物质，对不同柱子也不一样。,塔板理论的成功与不足,成功：1、导出了色谱流出曲线的数学表达式；2、说明了色谱峰的形状呈正态分布；3、
11、解释了浓度极大点；4、提出了评价柱效的参数(n)及其计算式 不足：1、仅考虑了热力学因素，没有考虑动力学因素；2、不能说明影响柱效的因素及谱带扩张的原因；3、不能说明流动相流速对柱效的影响，而实验事实是流速不同时测得的n(或H)不同,2.5 速率理论,2.5.1 气相色谱法,色谱过程的动力学理论塔板高度H 与载气线速度的关系,A 为涡流扩散项，B 为分子扩散项系数，C 为传质阻力项系数，为载气的平均线流速,范弟姆特方程,1涡流扩散项A,A=2dP,：填充不规则因子dP：填充物颗粒的平均直径,影响：填充物颗粒的大小、分布以及填充均匀的程度；不受影响：载气性质、线速度和组分无关。减小涡流扩散提高柱
12、效的有效途径：使用适当小的颗粒，且颗粒均匀的填充物，并尽量填充均匀。对于空心毛细管柱，A=0。,A=2dP,与颗粒的均匀程度有关及填充的均匀程度有关,2分子扩散项,分子扩散项的系数B：B=2Dg,：弯曲因子Dg：组分在气相中的扩散系数(cm2s-1),与填充物有关：对于填充柱，=0.50.7；对于毛细管柱，=1.0。Dg与组分的性质、载气的性质、柱温和柱压等因素有关：分子量大的组分Dg小；Dg反比于载气分子量的平方根,故采用分子量较大的载气可使B项降低；Dg随柱温升高而增大，而随柱压增大而减小。,B=2Dg,3传质阻力项 C,传质：物质因浓度不均匀而发生的迁移过程称为传质 传质阻力：影响此迁移
13、过程速度的阻力称为传质阻力 传质阻力种类：包括气相和液相传质阻力，而传质阻力系数也包括气相传质阻力系数Cg和液相传质阻力系数Cl,C=Cg+Cl,气相传质过程,气相传质过程是待测组分从气液界面移动到气相内部而后又移动到液相表面的过程。,影 响：Cg与填充物粒度dp的平方成正比，与组分在载气流中的扩散系数Dg成反比。解决方法：因此采用粒度小的填充物和分子量小的气体作载气可使Cg减小,从而提高柱效。,对于填充柱：,气相传质阻力系数,液相传质过程,液相传质过程是指待测组分从气液界面移动到液相内部，发生质量交换以达到分配平衡，然后又返回气液界面的传质过程。,影 响：固定相液膜厚度（df）和组分在液相中
14、的扩散系数（Dl）。解决方法：减小液膜厚度df，增大组分在液相中的扩散系数Dl，均可提高柱效。,液相传质阻力系数,速率理论方程,填料性质：填料颗粒均匀程度、填料颗粒大小填充情况：填料在色谱柱中填充均匀程度流动相：流动相种类和流速固定相：固定液厚度,公式说明影响n或H的因素,结论：范弟姆特方程对色谱分离条件的选择具有指导意义,2.6 分离度(Rs),2.6.1 定义,Rs是相邻两组分色谱峰保留值 和 之差与两个组分色谱峰峰底宽Y1和Y2总和的一半的比值,衡量色谱图中相邻两峰分离程度,意义,热力学因素（两峰离开距离）,动力学因素（两峰宽窄）,不同分离度下色谱峰示意图,通常用Rs=1.5 作为相邻两
15、色谱峰完全分开的指标,R=0.8：两峰的分离程度可达89%；R=1：分离程度98%；R=1.5：达99.7%（相邻两峰完全分离的标准）。,R=0.75 R=1 R=1.5,2.5.2 色谱分离基本方程式,假定，则,又,将 代入上式，,得,假定，的情况下，分离度方程简单地表示为：,分离度方程或色谱分离基本方程式,意义,指出了可以通过改变n、a和k等参数来控制分离度,根据这一公式可得,进而导出,2.5.3 影响分离度的因素,1、增加柱长，可以改进分离度2、增加 n 的另一个方法是减小H,1柱效的影响,Rs 与 成正比,2.5.3 影响分离度的因素,柱容量项随 k 的增大而增加，也随之增加；当 时，其对 的改进已不明显；k 值太大时，会大大延长分析时间，峰展宽；k 的最佳范围一般控制在110之间。,2分配比（容量因子）的影响,柱容量项,越大，,Rs也随之增加；,值从1.01增加至1.10，可使Rs增加9倍。,值是提高分离度最有效的方法。,增加,2.5.3 影响分离度的因素,3选择性的影响,影响分离度的因素,在n，k和a系数中，增大a对提高Rs最有效。当a1.5时，a的改变对Rs影响较小。,xiexie,谢 谢,
