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1、第七章 色谱联用技术,7.1 色谱联用分析技术概述,1.联用技术的必要性 每种分析方法都有其特长和局限性。局限性来自两个方面：原理方面，不可逾越；技术方面，可以改进、发展。在线联用不仅能取长补短，而且还具有协同作用，获得两种技术单独使用时所不具备的某些功能。,2.实现在线联用的关键 硬件接口（hardware interface）用于协调联用的两种仪器的输出和输入之间的矛盾，使两种仪器连接成一个整体。,3.色谱联用技术发展现状色谱：分离光谱：结构鉴定 两者联用，不仅可以对混合物中的各未知组分进行定性，也可用于定量分析。GC-MS,GC-FTIR,LC-MS,LC-FTIR,LC-NMR,LC-
2、ICP-AES,7.2 气相色谱质谱联用GC-MS,1.气相色谱与“四谱”工作条件的适应性,2、气质联用接口（协调输出/输入的矛盾）,工作气压不匹配是实现 GCMS联用的主要困难。GC柱的输出为100 kPa，而MS离子源在小于103 Pa的条件下工作。接口的作用是将 GC流出的载气气压降低到MS 能够接受的程度，并将样品送入MS离子源接口的类型喷射式分子分离器，早期，适合于填充柱；通过传输线直接连接，适合于毛细管柱。,喷射式分子分离器的结构,作用：降低气压；浓缩样品。,出口,气相色谱,高真空泵,传输线,化学工作站软件（计算机）,离子源,质量分析器,机械泵,检测器,质谱,3.仪器结构,GC-M
3、S组成：GC：低流失毛细管柱 载气必须用99.999%的氦气 离子源：电子轰击源、化学电离源 MS：四极杆质谱仪、离子阱、飞行时间质谱仪 接口：细口径毛细管柱通过传输线直接连接 粗口径分流 数据系统：计算机 数据库 真空系统：分子涡轮泵,4、质量分析器,四极杆质量分析器飞行时间质量分析器离子阱质量分析器磁质量分析器傅里叶变换离子回旋共振质量分析器多个质量分析器的串联（串联质谱联用）,1.四极杆质量分析器（Quadrupole Mass Filter）,对于给定的直流DC和射频电压RF，特定质荷比的离子在轴向稳定运动，其他质荷比的离子则与电极碰撞湮灭。将DC和RF以固定的斜率变化，实现质谱扫描功
4、能。,特点：（1）结构简单，体积小，价格便宜（2）扫描速度快，与色谱出峰速度匹配，适合联用（3）可串联使用（4）无需狭缝分离，灵敏度高（5）质量分辨率不高(小数点后1位）（6）检测的m/z范围小,2.离子阱质量分析器(ion trap),特定m/z离子在阱内一定轨道上稳定旋转，改变端电极电压，不同m/z离子飞出阱到达检测器；,特点：（1）结构简单，体积小，价格低（2）扫描速度快，与色谱出峰速度匹配，适合联用（3）自身可做多级，有利于定性（4）质量分辨率6000-9000（5）检测的m/z范围小,3.飞行时间质量分析器(TOF),具有相同动能、不同质量的离子，其飞行速度不同而分离。如果固定离子飞
5、行距离，则不同质量离子的飞行时间不同，质量小的离子飞行时间短而首先到达检测器。,特点：（1）结构简单，体积较大，价格略贵（2）扫描速度快，与色谱出峰速度匹配，适合联用（3）灵敏度高（4）质量分辨率高（5）检测质量无上限,气相色谱-四极杆质谱仪,4.气质联用系统提供的信息,GC-MS-Computer的工作过程：GC：各组分被色谱柱分离，随时间变化依次从柱子流出，通过接口进入MS。MS：连续扫描MS图，每扫描一张MS图需花费约零点几到几秒钟。总扫描时间(扫一张图谱的时间)扫描次数计算机：将得到的所有MS数据存储起来，供下一步的处理和输出。,(1)总离子流图（TIC）,质谱仪检测到的所有离子信号（
6、不分其质荷比）的总和对时间t作图相当于气相色谱图。没有组分通过时为基线；当组分流出时，即出现峰。记录方法：TIC检测器；计算机采集和存储连续、重复扫描的信息，然后进行数据处理。,TIC图中的每一个峰代表一个组分；峰的位置就是该组分的色谱保留时间；峰面积与组分的相对含量有关。,某种天然蜡质衍生物的GCMS总离子流图,(2)每个组分的质谱图,可从质谱图获得组分的分子量和分子结构信息。谱库检索 根据NIST，INCOS，PBM三种算法，将未知物图谱与谱库中的标准图谱比较，匹配度越高，可信度越高,序号 化合物名称序号 化合物名 1 十六碳酸 12二十九碳烷 2 9,12-十八碳二烯酸 13三十碳烷 3
7、 十八碳酸 14二十六醇乙酸酯 4 二十四碳烷 15三十一碳烷 5 二十醇乙酸酯 16结构未定*6 二十五碳烷 17三十二碳烷 7 二十六碳烷 18二十八醇乙酸酯 8 二十二醇乙酸酯 19 结构未定*9 二十七碳烷 20三十四碳烷10 二十八碳烷 21三十醇乙酸酯11 二十四醇乙酸酯 2225结构未定*,由GCMS确定的某天然蜡衍生物的成分,(3)质量色谱图（提取离子流图）,以指定质荷比的离子强度（而不是总的离子流强度）对时间t（或扫描号）作图。是计算机进行数据处理得到的图。优点：可在复杂混合物的TIC图中,迅速找到所需检测的化合物或同系物。,某天然蜡衍生物的总离子流图和质量色谱图,（用于寻找
8、一类成分）,质量色谱图,总离子流图,（用于寻找微量成分）,5.GC-MS的应用,凡是能用气相色谱分析的试样，均适合于 GC-MS分析，如环境污染物的分析香精、香料的成分分析和质量评价中草药的挥发性成分鉴定药物及其他化工产品的分析毒物、毒品及违禁药物的鉴定和检测等等。,（1）GC-MS定性分析 分析条件的设定 GC条件：同普通CGC MS条件：扫描方式，扫描范围，扫描速度,灯丝电流，倍增器电压等 定性分析 进样，电离，质谱数据的采集，谱图检索,GC-MS定量分析依据 用总离子色谱图定量 用质量色谱图（提取离子色谱图）定量 用选择离子色谱图定量（SIM，选择离子监测）对串联质谱还可以用MRM（SR
9、M，反应离子监测）定量优缺点GC-MS定量分析方法：内标法，外标法，归一化,（2）GC-MS定量分析,有机氯农药的GC-MS总离子流图,7.3 液相色谱-质谱联用技术LC-MS,一、实现 LC-MS 的困难 1.LC 流动相对MS工作条件的影响1ml溶剂气化生成 500-1300ml的蒸气，而质谱仪只能接受10 ml/min气体流量。有时流动相中含难以挥发的缓冲盐2.质谱离子源温度、电离方式不适宜液相色谱所分析的样品。,二、接口系统,1.脱溶剂2.使被测物电离,1.粒子束接口（Particle-Beam,PB）,根据流体力学原理，利用样品与溶剂动量的不同将它们分开形成气溶胶脱溶剂动量分离得到的
10、谱图与电子轰击质谱图非常相似，可利用标准谱图检索现少使用,2.电喷雾电离（ESI，接口+软电离技术）,RayleighLimitReached,+,+,+,+,+,+,-,-,+,+,Charged Droplets,试样离子,准分子离子,Analyte IonsSolvent Ion ClustersSalts/Ion pairsNeutrals,+,+,其他离子,电喷雾电离，Electrospray,流出液在高电场下形成带电喷雾，在电场力作用下穿过气帘。气帘的作用：雾化；蒸发溶剂；阻止中性溶剂分子,特点：是LC-MS的基本配置接口是一种软电离方式，适合稳定性差、极性大、分子量大的物质的电离
11、。主要生成准分子离子（M+H+、M-H-、M+Na+等），生物大分析产生多电荷离子。灵敏度高不能进行谱库检索不适用于非极性化合物的分析,对于大分子化合物，电喷雾产生多电荷离子，相对分子质量Mr计算方法如下：选相邻峰，电荷n，n+1m1=(Mr+n+1)/(n+1)m2=(Mr+n)/n,分子量约为12200的细胞色素的 ESI质谱图,3.大气压化学电离(Atmospheric Pressure Chemical Ionization,APCI),热喷雾(100-120C)，化学电离;适用于弱极性和热稳定化合物分析.,特点：化学电离，软电离技术，产生的碎片很少 适用于弱极性、分子量小（2000D
12、a）和热稳定化合物分析 灵敏度高 ESI的补充技术,ESI APCI,硬件 毛细管有几千伏高压 放电针 电离 液滴中的离子蒸发 类似于化学电离原理 属于液相电离 属于气相电离应用*适合的LC流速为 0.22ml/min 0.20.3ml/min*极性和离子化合物 极性较小的化合物*可产生多电荷离子 产生单电荷离子,LC-MS(四极杆)联用仪器结构示意图,LC-MS(离子阱)联用仪器结构示意图,医药、临床：药物代谢、药物动力学、杂质分析、天然产物分析、疾病诊断生物化学：肽、蛋白质、寡核苷酸、糖环境化学：农药和农残分析、有机污染物、土壤/食品/水分析食品科学：香料、添加物、包装物、蛋白质、致癌物化
13、学：有机合成物,三、液质联用的应用,TIC Spectrum of Four Diterpenoids of Radix Salviae Miltiorrhizae,丹参中四种丹参酮的lc-ms-ms测定,LC-MS-MS MRM Chromatograms of Radix Salviae Miltoirrhizae Sample,反应离子监测,7.4 高效液相色谱-核磁共振联用技术LC-NMR,一、HPLC与NMR的比较及联用的困难 HPLC NMR分析对象 有机物样品状态 液态操作温度 室温扫描时间 大体相同操作方式 连续流动 间歇灵敏度 gng mg溶剂 普通 氘代溶剂,二、问题的解决
14、,主要取决于核磁共振技术的提高和发展（1）灵敏度 仪器方面高频仪器的使用：NMR的信噪比与磁场强度的平方成正比，800 MHz(18.79T)与100 MHz(2.35T)仪器相比，信噪比增大约64倍。用新技术提高信噪比：软件滤波，消噪技术,操作参数的影响提高LC柱的负载量 内径4.6mm色谱柱，合适的负载量为100g。采用停流技术 增加检测的有效时间（多次扫描累积）。把射频线圈直接绕在流通池壁上，减少死体积。（2）溶剂使用氘代溶剂使用脉冲序列等溶剂抑制技术,采用WET序列进行溶剂峰抑制的实例,乙腈溶剂峰,三、联用方式,实验布局 泵、注入阀、色谱柱和紫外检测器组成的LC系统，通过一条2-2.5
15、m的特制毛细管连接到NMR液相探头上，探头底部有阀控制NMR测定方式。,液相探头带有一个流动腔；射频发射线圈垂直固定在流动腔的玻璃管上；接受线圈平行于玻璃管；流动腔不能旋转，NMR测定分辨率较差。,联用模式,连续流动模式 LC的载液带着试样组分连续不断流入NMR的流动腔，NMR仪器用溶剂峰抑制技术采集NMR谱图，得到化学位移LC保留时间的假二维谱。得到的谱图分辨率和信噪比差。停流技术（时间切割谱）当色谱峰的最高点到达流动腔的检测位置时，关闭液相探头底部的进口阀，同时LC的泵停止工作，NMR进行采样直到获得满意的谱图。,峰存储模式(peak parking)实际上是一种离线模式。由LC流出的峰存
16、储在毛细管回路中，然后通过适当的阀系统依次送入NMR探头中进行NMR测定，LC分析过程不中断。体系中有三个阀，12个存储峰的毛细管回路，整个过程由计算机控制。,峰存储模式,三种联用模式的比较,流动模式：灵敏度和信噪比差，适合于测定富核，如1H、19F、31P和富集的13C、15N；对1H最小检测量（16次累加）为10g（500MHz），30g（300MHz）；停流模式：有较好的灵敏度，可测1H、13C、15N等。最小检测量1H为1g；峰存储模式：与停流模式类似。,应用实例,耐哌地尔杂质的检测,7.5 色谱-傅立叶变换红外光谱联用(GC-FTIR),1.GC-FTIR联用概述（1）GC-IR联用
17、的作用 MS一般难于区分同分异构体，IR是很好的补充。（2）实现GC-IR的困难 扫描速度、灵敏度、物理状态均不匹配（3）解决方法 FTIR：具有信噪比好、扫描速度快等优点，与GC的匹配性大大提高。物理状态：测气体红外。,2.GC-FTIR系统,光管,GC-FTIR接口示意图,接口-光管,用硼硅玻璃制成；两端装有KBr盐窗，红外干涉光可以通过；内壁镀金，有高的反射率，红外干涉光在其中多次反射，增加光程以提高灵敏度；可加热，保证GC流出物不在此冷凝；适当的容积，以获得最佳分辨率和灵敏度；尾吹装置：用以解决毛细管GC柱与传输线（）、光管(1mm)中线速变化的问题。即柱外效应的问题,3.GC-FTI
18、R提供的信息,(1)三维实时显示图,(2)化学图（Chemigram）(官能团色谱图),指定官能团频率范围对时间所作的图；是一个“色谱图”，每个峰代表一个组分；包含的信息比一般的色谱图多，它体现了化合物类型或所含官能团的信息；与GC-MS中的质量色谱图作用相似。,12001100,16001500,17801680,30502950,36503550,乙醇、丙酮、乙酸乙酯和苯的混合物的化学图,(3)红外重建色谱图,GC-FTIR采集的数据经计算机处理后得到的红外吸收信号对时间所作的图。积分吸收重建图(红外总吸光度重建图 TIA)，相当于GC-MS中的总离子流图(TIC)。Gram-Schmid
19、t重建色谱图 扣除了载气背景的积分重建图。最大重建色谱图 对每个峰的最大吸收进行积分重建,相当于GC-MS中的RTIC图。,积分吸收重建图,Gram-Schmidt重建色谱图,(4)蒸气相红外吸收光谱图,乙醇 丙酮,四、GC-FTIR应用实例,与GC-MS相比在鉴定同分异构体方面占优势。如芳环的替代位置，顺反异构，环连接方式，环上异构等存在问题：灵敏度比GC-MS低，一般低两个数量级。高沸点样品的分析有困难。因光管使用温度受限制。蒸气相红外光谱图库中谱图数量较少。,五、GCFTIRMS联用,一次进样便可获得分离及红外、质谱互补的鉴定信息。更加省时、省力、省样。在1987年出现商品仪器。GC进样后，可实时、同时显示红外的总响应图（TRC）、质谱的总离子流图（TIC）及每次扫描的蒸气相红外光谱图和质谱图，并可对指定组分的红外、质谱进行谱库检索，自动找出最佳匹配结果。联机方式：串联、并联,串 联,并联,分流,6种毒品的三机联用分析结果,组分1(咖 啡 因),组分2(美 洲 酮),
