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1、2023年7月31日,Choose View,Header and Footer to enter text here,1,食品中有毒有害物质的分析气相色谱/质谱联用技术和液相色谱的应用,1，饲料中-兴奋剂（盐酸克仑特罗）的分析2.NDMA（N-亚硝胺）的测定3.海产品中的药物残留的分析4.酱油中的氯丙醇的分析,2023年7月31日,Choose View,Header and Footer to enter text here,2,GC/MSD 或 HPLC-UV法,饲料中盐酸克仑特罗(Clenbuterol)的测定,2023年7月31日,Choose View,Header and Foo
2、ter to enter text here,3,盐酸克仑特罗(Clenbuterol),盐酸克仑特罗是一种肾上腺素兴奋剂，主要用于防治人，畜支气管哮喘和支气管痙挛，治疗剂量较低。在饲料中添加盐酸克仑特罗具有营养再分配作用，提高饲料报酬，提高瘦肉率的效果。盐酸克仑特罗在肌肉特别是在内脏中会有高浓度的残留，对人与动物的肝，肾及神经系统产生危害。欧盟最早颁布法规禁止其作为饲料添加剂使用，美国和加拿大也禁用，我国农业部亦发文作出同样规定。,2023年7月31日,Choose View,Header and Footer to enter text here,4,盐酸克仑特罗,CH,OH,CH2NHC
3、(CH3)3 HCl,NH2,Cl,Cl,白色结晶粉末，可从SIGMA 公司购买，可溶于水。,2023年7月31日,Choose View,Header and Footer to enter text here,5,GC/MSD 方法,样品中的盐酸克仑特罗经提取，净化，衍生化，采用AGILENT5973N GC/MSD SCAN 方式进行测定，外标法定量。方法回收率为92%-99%，检出限为低于0.2 ppm。,2023年7月31日,Choose View,Header and Footer to enter text here,6,样品处理,提取：,饲料样品10克,加50ml 0.01mo
4、l/L HCl溶液,超声清洗器,萃取30min,离心10 min,上清液,如有必要，重复一次,2023年7月31日,Choose View,Header and Footer to enter text here,7,样品处理,净化,上清液,加2.0 ml 5 mol/L NaOH溶液，加入10 ml 氯仿,振荡萃取。,60水浴中真空蒸发氮气吹干,重复二次,衍生化,加 1.0 ml氯仿溶解，再加入 0.1ml乙酸酐衍生试剂。,氮气吹干，加0.5 ml 氯仿溶解,2023年7月31日,Choose View,Header and Footer to enter text here,8,色谱与质谱
5、条件,色谱条件：HP5MS 30m X 0.25mm X 0.25um 进样口：250，不分流，进样量2ul，柱温：120（3min）20/min 220（10 min),质谱条件：EI源，接口温度280，质量扫描范围50500AMU 溶剂延迟：3min。,2023年7月31日,Choose View,Header and Footer to enter text here,9,Clenbuterol 的标准质谱图,2023年7月31日,Choose View,Header and Footer to enter text here,10,HPLC 法,采用反相高效液相色谱法用水相和有机相二次
6、提取饲料中的盐酸克仑特罗，可减少饲料中杂质的干扰。UV检测器，C18柱回收率在8595，检出限0.2ppm,2023年7月31日,Choose View,Header and Footer to enter text here,11,色谱条件,C18柱，250mm X 4mm；流动相：甲醇：水65：35检测波长，UV243nm，流速：0.85ml/min进样量：20ul或者：流动相：甲醇：水55：45，流速 0.80ml/min.,2023年7月31日,Choose View,Header and Footer to enter text here,12,样品处理,饲料样品20g,加盐酸70m
7、l浸泡过夜，超声振荡20min，定容，静置,取上清液离心10min,上清液10ml于分液漏斗,滴NaOH碱化，振摇5min，用正己烷提取二次，每次20ml，合并正己烷层，定容至50ml。取5ml，水浴蒸干，加甲醇溶解。,样品溶液,2023年7月31日,Choose View,Header and Footer to enter text here,13,动物毛发 尿液及组织中的盐酸克仑特罗及舒喘宁（沙丁胺醇）的测定,本方法适用于检验动物毛发、尿液及组织中克喘素及舒喘宁的测定。组织和尿液样品用盐酸葡萄糖醛甙酶/芳基硫酸酯酶在Ph=5.2的缓冲溶液中消化。萃取的组织样液通过离心和过滤分离。尿液和毛
8、发样品作用有机溶剂萃取。所有萃取液均用固相萃取净化，分离的药物残留经过双三甲基硅基三氟乙酰胺（BSTFA）衍生后用带有质量选择检测器的气相色谱仪测定。,2023年7月31日,Choose View,Header and Footer to enter text here,14,试剂,-乙酸胺缓冲液（20mM,pH=5.2）、溶解1.45g乙酸胺于500700 mL水中，用乙酸调整pH值为5.2并稀释到1升。-盐酸葡萄糖甙酶/芳基硫酸酯酶溶液30U/mL或相当者-十二烷基磺酸钠（SDS）：1%-30mM盐酸：稀释30mL 1M盐酸到1升蒸馏水中。-甲醇：分析纯。-氨化甲醇（amonium met
9、hanol）：4%。用甲醇稀释4mL氨溶液（比重0.88）至100mL。-BSTFA。-甲苯：分析纯。-乙酸乙脂-异丙醇（6：4）：分析纯。-C18小柱：supelclean LC-18 Sep Pak小柱500mg，3ml。-SCX小柱：supelclean，LC-SCX Sep Pak小柱500mg，3ml。,2023年7月31日,Choose View,Header and Footer to enter text here,15,标准溶液,标准溶液储备液：1000ppm（1mg/mL）克喘素（4氨基-t-丁基氨基-甲基-3，5二氯苯基乙醇盐酸盐。精确称取约100mg舒喘宁，溶解于100
10、mL甲醇中。舒喘宁（t-丁基氨基-甲基-4-羟基-m-苯乙烯-，-二醇）精确称取约100mg舒喘宁，溶解于100mL甲醇中。中间溶液：30ppm（30ug/mL）分别移取3mL上述储备液（1mg/mL）定容至100mL甲醇中。工作溶液：0.3ppm(30ug/mL)移取1mL上述储备液（30ug/mL）用甲醇定容至100mL。,2023年7月31日,Choose View,Header and Footer to enter text here,16,离心瓶，50 mL。Sep-Pak真空接头。具聚四氟乙烯拧盖的试管。食品绞碎机。机械真空泵触摸式震荡器。恒温箱：37+3 oC恒温箱：80+3
11、oC恒温箱：100+3 oC气相色谱仪，配质谱检测器。,仪器设备,2023年7月31日,Choose View,Header and Footer to enter text here,17,动物组织（肉、肾脏、肝脏、肺、心脏等）。绞碎组织样品1min。准确称取10+1.0g已绞碎的样品于50 mL具拧盖的离心管中。加入20mL20mM的乙酸缓冲溶液，均质5min。加入50L-盐酸葡萄糖醛甙酶溶液。拧紧盖子，震荡、超声15min。于37 oC培养18hr。于3000 rmp离心5min，过滤上清液。收集滤液以备净化。,动物组织的提取过程,2023年7月31日,Choose View,Heade
12、r and Footer to enter text here,18,用移液管移取5mL尿样于50mL具拧盖的离心管中。用乙酸调整pH值至5.2。加入1mL20mM的乙酸胺缓冲溶液。加入50L盐酸葡萄糖醛甙酶溶液。拧紧盖子，震荡、超声15min。于37 oC培养18hr。加入10mL乙酸乙酯-异丙醇混合液，震荡15min。用滴管收集有机相。用10mL上述混合液重复提取一次。合并两次提取的溶液于一玻璃试管中。用氮气吹干。用1mL20mM的乙酸胺缓冲溶液溶解。,尿样的提取,2023年7月31日,Choose View,Header and Footer to enter text here,19,
13、取约1g毛发至500mL烧杯中，用100mL1%SDS溶液冲洗。搅拌上述溶液30min，使之分散。再用100mL1%SDS溶液冲洗一次。用蒸馏水清洗毛发样品，去除SDS溶液。于40 oC的烘箱中烘干样品。切碎毛发。准确称取500mg毛发样品于具拧盖的试管中。加入10mL甲醇，超声30min。拧紧盖子在60 oC的烘箱中加热2hr，并不时震荡。离心甲醇提取液。再用10mL甲醇提取一次，在60 oC的烘箱中加热1hr。合并两次甲醇提取液。用氮气吹干。用1mL20mM的乙酸胺缓冲溶液解。,毛发样品的提取,2023年7月31日,Choose View,Header and Footer to ente
14、r text here,20,样品的净化,装好真空泵和接管，将C18和SCX固相萃取柱按从上到下的顺序安装。依次用5mL甲醇、5mL水和5mL30mM盐酸活化。取5mL滤液（4.1.1.8）至C18柱中。对于尿和毛发样品，移取1mL所得到溶液（4.2.1.2或4.3.1.4）至C18柱中。用1mL20mM的乙酸胺缓冲溶液冲洗试管并一起转移至C18柱中。依次用5mL甲醇、5mL水淋洗柱子。在溶液渡过固相萃取柱后，保持抽气5min使柱中的液体逐渐枯竭。取下C18柱。用5mL4%氨化甲醇（2.6）淋洗SCX柱并收集流出液于具塞玻璃试管中。衍生化、检测用氮气吹干上述流出液。用100L甲苯溶解残渣。加入
15、100L BSTFA，加盖并于触摸式震荡器上震荡。在80OC的烘箱中加热1hr。蒸干多余的溶剂。用0.5mL甲苯溶解。,2023年7月31日,Choose View,Header and Footer to enter text here,21,（HP6890配5973或相当者）。气相色谱仪参数（仅供参考）。色谱柱：HP-5MS5%苯基甲基聚硅氧烷，30mX0.25umX250um进样口：220 OC进样方式：不分流进样体积：2L柱头压（70 OC）：7.6psi柱温：70 OC（保持0.6min）以25 OC/min升温至200 OC（保持6min）以25 OC/min升温至280 OC（保
16、持5min）流速：0.9mL/min（恒流）,气-质联用仪参数,2023年7月31日,Choose View,Header and Footer to enter text here,22,传输线温度：280 OC溶剂延迟：8minEM电压：高于调谐电压（-15000）200分析杆温度：106 OC。选择离子监测程序（仅供参考）时间目标物监测离子8：00克喘素 86，243，262，277 11：55舒喘宁 86，147，207，369,质谱仪参数（仅供参考),2023年7月31日,Choose View,Header and Footer to enter text here,23,方法小结
17、,两个-兴奋剂的检测限为1.5g/kg。组织中克喘素和舒喘宁的平均回收分别为75.5%+12.8%和72.8%+18.3%,2023年7月31日,Choose View,Header and Footer to enter text here,24,N-亚硝胺残留分析,N-亚硝胺(NDMA)是一类很强的化学致癌物,在自然界分布很广泛,如食品,药物,化妝品等.GC/MS 结合大体积进样技术测定NDMA,准确可靠,灵敏度高,操作简单.,2023年7月31日,Choose View,Header and Footer to enter text here,25,氨代亚硝基二甲胺(N-Nitrosod
18、imethylamine,NDMA),The problem:NDMA被怀疑是一种强致癌物和致崎物 NDMA,has been regulated in drinking water sources at the 0.7 ng/L(ppt)level by the US-EPA and at 2 ng/L(ppt)by California Dept.of Health Services.Existing methods have quantitation limits in the 7-100 ng/L range and detection limits at best 1-3 ng/l;
19、higher than the regulated limits.,Losses increase with sample evaporation using either SPE or Liq/Liq extraction.The electron impact ionization spectrum for NDMA is not very favorable.,25,2023年7月31日,Choose View,Header and Footer to enter text here,26,样品处理,200g食品切碎于蒸馏瓶,加100ml水,120gNaCl,用装有40ml二氯甲烷的接收
20、瓶收集溜出液400ml,加入80gNaCl合3ml 1:3硫酸溶液120ml二氯甲烷分三次提取,提取液,无水硫酸钠脱水定容至1ml,样品溶液,2023年7月31日,Choose View,Header and Footer to enter text here,27,IntroductionIn typical GC/MS analyses,only a fraction of the injected components is of analytical interest;the remainders are interferences or uninteresting(e.g.,samp
21、le solvent,matrix related,etc.).Eliminating these unnecessary components provides substantial improvements;Increased analytical integrity,less frequent maintenance,etc.These concerns become amplified in Large Volume Injection(LVI).,27,大体积进样技术（LVI）,2023年7月31日,Choose View,Header and Footer to enter te
22、xt here,28,LVI（大体积进样）进样技术的原理,28,2023年7月31日,Choose View,Header and Footer to enter text here,29,仪器配置6890 GC-5973 Mass Selective Detector with APEX ProSep 800 XT Plus Pre-separation Inlet and controller modules,Pre-separationColumn Module,29,2023年7月31日,Choose View,Header and Footer to enter text here,
23、30,LVI（大体积进样）的参数控制,30,2023年7月31日,Choose View,Header and Footer to enter text here,31,Experimental,To demonstrate ProSep Function in Large Volume Injection using a simple 4 component mixture.,目的,The ProSep preseparation column was phase coated with HT-5,contained HT-5 coated fibers and a plug of sili
24、ca wool in the upper 4-7 cm of the column.6890 Plus GC with ALS made all injections onto 30m,.25 mm id,.25 um film HP-5 MS column.MSD was operated in full scan,.,31,2023年7月31日,Choose View,Header and Footer to enter text here,32,LVI（大体积进样）的优势,LVI allows greater flexibility by providing the choice of
25、Lowered detection limits with an existing extraction methodology OR Less Sample Prep/Extractionwhile maintaining required detection limits,ProSep has applications demonstrating both approaches and others(e.g.,derivatization“during injection”,),32,2023年7月31日,Choose View,Header and Footer to enter tex
26、t here,33,LVI 和化学电离质谱,=提高选择性和灵敏度,20 attograms/ul of Octafluoronaphthaleneacquired using LVI with ECNI MS on 5973(44,000 molecules/ul),33,2023年7月31日,Choose View,Header and Footer to enter text here,34,PCI+SIM+LVI 技术分析NDMA,34,2023年7月31日,Choose View,Header and Footer to enter text here,35,NDMA分析的线性及重现性
27、,NDMA quantitation curve from 20 fg/ul to 4000 fg/ulr2=0.999,Reproducibility in 75/92 m/z ratio and response(n=5)for concentrations of NDMA from 20 to 4000 fg/ul,35,2023年7月31日,Choose View,Header and Footer to enter text here,36,结论,Apex ProSep Preseparation Inlet,Behaves as a Chromatographic Zone Inl
28、et SystemPerforms separations in Large Volume Inlet modesIncreased analytical integrity,lowered column and detector maintenance,etc.Work with authentic samples and a wide variety of matrices has shown the ProSep to be very reproducible and robust.Injection(1 to 125 ul)is rapid so sample throughput i
29、s high.,36,2023年7月31日,Choose View,Header and Footer to enter text here,37,水产品中土霉素、四环素、金霉素残留量的测定方法,本方法为HPLC方法，最低检出浓度为0.05mg/kg、0.05mg/kg、0.1mg/kg。原理：样品经提取，SPE纯化，微孔膜过滤，直接进样，用反相色谱分离，UV检测，外表法定量。出峰顺序为土霉素、四环素、金霉素。,2023年7月31日,Choose View,Header and Footer to enter text here,38,样品预处理,，,称取5.00g肉样于50ml离心管中,加入
30、5高氯酸溶液20ml，匀浆10分钟，振荡提取10分钟，,以4000r/min离心10分钟，取上清液用0.45um滤膜过滤,在离心管残渣中再加入5%高氯酸溶液10ml,重复操作一次,合并.,上清液,2023年7月31日,Choose View,Header and Footer to enter text here,39,上清液,过Sep-C8柱(10ml甲醇、10ml 15EDTA2Na溶液、20ml蒸馏水活化）过30ml蒸馏水洗去杂质，10ml甲醇洗脱,洗脱液,40水浴中氮气吹，浓缩至1ml0.45um滤膜过滤,样品溶液,2023年7月31日,Choose View,Header and F
31、ooter to enter text here,40,分析条件,仪器条件：HP1100 UV 检测器色谱条件：柱ZOBRBAX SB18，4.6mm X 250mm,ODS-C18(HP)检测波长:355nm 柱温:37 流速:0.8ml/min 进样量:30ul 流动相:乙晴/0.01M/磷酸二氢钠溶液(用磷酸调节pH2.5)26:74(V/V),2023年7月31日,Choose View,Header and Footer to enter text here,41,酸水解植物蛋白调味液中三氯丙醇的测定,1.三氯丙醇问题的提出:-1988年Velisek等在酱油中发现一种有机成分-氯丙
32、醇以来,引起了食品学界的高度重视.-1991年Collier等对氯丙醇的形成机理做了进一步的研究;-1993年世界卫生组织对氯丙醇的毒性提出了警告;-1995年欧共体委员会食品科学分(ECSCFF)对氯丙醇的毒理作了 评价,并指出氯丙醇作为一种致癌物,其最低阀值应为不检出为宜.,2023年7月31日,Choose View,Header and Footer to enter text here,42,2.氯丙醇的来源一.脂质:蛋白质水解可用酸水解和碱水解,但是碱水解会引起精氨酸、胱氨酸及部分赖氨酸被破坏，因此工业上是采取浓盐酸水解植物蛋白质或动物蛋白质的方法来生产的。在原料植物/动物蛋白质中
33、有脂质,主要有三酰甘油酯类和甘油磷酯类,而这些脂质在浓盐酸中会发生水解反应,产生氯丙醇.二.某些环氧树脂:以表氯丙醇为单体制成的环氧树脂已广泛地应用在涂料,粘结剂及乙烯树脂的稳定剂,环氧树脂是目前食品工业中的主要包装材料之一,而表氯丙醇可水解为3-氯丙醇.三.其他来源:袋泡茶的包装袋;以含氯的凝聚剂作为水的净化剂;以3-氯-1,2-环丙烷来加工的变性淀粉.,酸水解植物蛋白调味液中三氯丙醇的测定,2023年7月31日,Choose View,Header and Footer to enter text here,43,国别 资料来源 1,3-二氯-2-丙醇 2,3-二氯-1-丙醇 2-氯-1,
34、3-丙醇 3-氯1,2 丙醇 德国标准 SKS 0.05ppm 0.1 ppm 未提及 0.05ppm美国食品 FCC 0.05ppm 未提及 未提及 1ppm用化学品法规(FCC)英国食品 FAC 0.05ppm 未提及 未提及 0.01ppm 顾问委员会FAC瑞士 0.05ppm 未提及 未提及 10ppm 中国 未提及 未提及 未提及 1ppm*,部分国家对3-氯丙醇的限量,2023年7月31日,Choose View,Header and Footer to enter text here,44,酱油中3-氯丙醇的分析方法,酱油是微生物发酵产物，成分很复杂，国外普遍采用毛细管色谱法进行
35、测定，即使这样也会因为分离效果不好而影响分析结果的可靠性。通过研究发现，将样品用苯基硼酸衍生化处理，转化为易挥发的物质，正己烷抽提后，用气相色谱-质谱联用仪的选择离子监测方法测定，提高了分辨率，且干扰少，灵敏度高，操作简单，结果准确可靠。,2023年7月31日,Choose View,Header and Footer to enter text here,45,实验部分,1.试剂衍生化试剂配制：称取10g苯基硼酸，溶于38ml丙酮和2ml蒸馏水的混合液中。标准试剂配制：称取25mg 3-氯-1，2-丙二醇，用200g/L NaCl溶液定容至250ml，得到100mg/L的标准溶液。然后分别移
36、取0.1ml，1ml，10ml至100ml容量瓶中，用200g/L NaCl溶液定容至刻度，即得0.1，1，10mg/L标准溶液。苯基硼酸，丙酮，正己烷，氯化钠均为分析纯。,2023年7月31日,Choose View,Header and Footer to enter text here,46,取样品或标准溶液5.0ml 置于10ml 带塞试管中，加入1.0ml 衍生化试剂，摇匀后，置于90恒温箱中反应20 min，停止加热，冷却后加入3.0ml 正己烷，强力振荡1min，离心，取上层清夜进行GC/MS分析。,2样品衍生化处理,2023年7月31日,Choose View,Header a
37、nd Footer to enter text here,47,气相色谱：HP6890气相色谱，HP-1的30m250m0.1m石英毛细管柱，载气为高纯氦气，柱温100，升温速率15/min升至250，进样口温度250，柱前压50Kpa。质谱：HP5973 GC/MS气相色谱-质谱联用仪，EI离子源，电子能量70 eV，离子源温度230，四极杆温度150，接口温度280，电子倍增器电压2100 V，检测方式SIM监测离子 m/z 147。,气相色谱-质谱测定条件,2023年7月31日,Choose View,Header and Footer to enter text here,48,3-C
38、PD产生机理：在酸水解法生产酱油的过程中，植物蛋白酸水解时伴随发生脂肪水解而产生丙三醇，丙三醇在盐酸作用下继续反应形成3-氯-1，2-丙二醇 植物蛋白,3.结果与讨论,2023年7月31日,Choose View,Header and Footer to enter text here,49,按上述实验条件分别进行标准溶液及样品溶液分析，以外标法计算3-CPD含量。3-氯-1，2-丙二醇苯基硼酸衍生物的质谱图见图1。其基峰为m/z 147。我们选择m/z 147进行SIM法，可获得满意的分离效果，其色谱总离子流图见图，保留时间为3.31min 的峰即为3-氯-1，2-丙二醇苯基硼酸衍生物。我们
39、分析了几种市面上的国产酱油，测定结果见表。可以看出，大部分酱油的3-CPD含量大大高于1.010-6，严重影响人体健康。样品名称 3-CPD含量(/10-6)样品名称 3-CPD含量(/10-6)生抽A 0.4 老抽A 0.5 生抽B 82.5 老抽B 125.8 生抽C 220.7 老抽C 158.5,2023年7月31日,Choose View,Header and Footer to enter text here,50,3-氯-1，2-丙二醇苯基硼酸衍生物质谱图,2023年7月31日,Choose View,Header and Footer to enter text here,51
40、,色谱总离子流图,2023年7月31日,Choose View,Header and Footer to enter text here,52,1.Pesselman R L,Feit M J.Determination of residual epichlorohydrin and 3-chloropropanediol in water by gas chromatography with electron-capture detection.J Chromatogr,1988,439(1-2):4482.Plantinga W J,Van Toon W G,Van Der Stegen G H D.Determination of 3-chloropropane-1,2-diol in liquid hy drolysed vegetable protein by capillary gas chromatography with flame ionization detection.J Chromatogr,1991,555(1-2):311,参考文献,
