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1、北京康为世纪生物科技有限公司,实时荧光定量PCR,Real Time Quantitative PCR,内 容,miRNA的特点及检测荧光定量PCR检测,microRNA,长度2024nt 单链小分子RNA与目标基因3端非编码区的识别位点相结合导致目标基因mRNA分子稳定性下降，半衰期变短，或mRNA分子结构变化（5脱帽），从而表达水平下降。,microRNA分子功能,microRNA 的来源,miRNA前体与成熟体,靶点识别不严格互补配对,一个miRNA可调节多个基因一个基因可受多个miRNA调控60%人类蛋白基因受miRNA调控,miRNA 与 siRNA的异同,分子形式无区别，都是由Di
2、cer产生的22nt小分子分子功能近似，都导致目标基因表达水平下降，但通常siRNA效果更剧烈产生来源不同miRNA有其基因，内源性表达siRNA多数情况下为人工外源导入,miRNA siRNA,miRNA 与 siRNA的异同,miRNA 检测与定量,经典方法:放射标记Northern杂交,miRNA芯片基因表达谱,基本原理：某物种全部已知miRNA集中于一张芯片，点杂交检测各miRNA丰度所回答的问题：哪些miRNA是你所应该关注的优点：高通量，全景观察缺点：敏感度、特异性均有限，适用于初筛需后续验证：荧光定量PCR,Pre-miRNA检测,必要性：不排除miRNA从前体到成熟体，从核内转
3、运到核外的过程中存在调控机制的可能。,Specific miRNA quantification by real time PCR way to go,关键难点丰度低解决办法:小RNA提取太短解决办法:加长序列高度相似miRNA之间难以区分解决办法:特殊设计的检测方法；小心设计引物与反应优化,解决miRNA丰度难题,基本原理影响RNA分子与硅胶柱结合的因素 离液剂chaotropic agent，如盐酸胍 离子强度，如NaCl 小分子有机溶剂，如乙醇精心调整各组份配比，达成大、小RNA与硅胶柱结合的区分条件，分离去除大分子量RNA，富集小分子量RNA,小RNA提取,M 1 2 3,M：Mark
4、er#1：康为柱式分离的小片段RNA#2：康为柱式分离的总RNA#3：沉淀法得到的总RNA,提取小分子量RNA,成熟 miRNA qPCR检测-Poly(A)加尾法,优点：简单直接，高效。一次逆转录获得的cDNA可用于多个目标分子的检测。,成熟 miRNA qPCR检测 茎环法,优点：特异引物逆转录，理论上效率更高，检测更灵敏缺点：茎环引物设计复杂；特异引物逆转录不便多基因检测,检测方法选择,依样本特性，检测目标多寡而定康为技术服务经验举例：复旦大学某客户miRNA芯片提示10个miRNA在病人与正常人之间有显著差异表达要求从66个外周血RNA样本中检测这10个miRNA加尾法，5个目标获得良
5、好检测茎环法，4个目标获得良好检测1个目标的检测很难，尝试多种引物设计，调整反应体系,康为miRNA产品,小RNA提取试剂盒加尾法 miRNA cDNA第一链合成试剂盒miRNA荧光定量PCR检测试剂盒,CW0627,CW2141,CW2142,康为miRNA检测服务,全套miRNA检测：从生物样本到数据茎环法 miRNA检测引物：定制,(Real time Quantitative PCR),miRNA的特点及检测荧光定量PCR检测,内 容,PCR：伟大的天才发明,Use of LSD Synthesis and self-testing of novel psychoactive subs
6、tances Belief in astrology,PCR：理想与现实,起点定量检测：-起点量是样本中未经PCR放大之前的模板量-具有重现性，误差小-“加入了500个拷贝”,终点定量检测：-终点产物量经过PCR放大的DNA量-不恒定，误差大-“生成了500，0000，0000个拷贝”,扩增曲线-Ct值：模板DNA量越多，荧光强度达到检测域值所需的循环数越少，即Ct值越小。,确定模板初始数量？,Real-time PCR:检测原理,非特异性荧光标记：SYBR Green I 特异性荧光标记：水解探针：TaqMan非水解探针：Molecular beacon,SYBR Green I 是一种与双
7、链DNA小沟结合的荧光染料。SYBR Green I只与双链DNA结合才能发出荧光。荧光信号的强度与反应体系中所有双链DNA分子成正比。,SYBR Green I 工作原理,Taqman 工作原理,在退火过程中，探针与靶序列结合,探针被Taq酶的5-3 外切酶活性剪切成片断,游离报告基团发出荧光,在延伸过程中，探针部分与靶序列分离,荧光信号强度与结合探针的DNA分子成正比。,染料法与探针法 对比,探针法特异性高-与探针与特异靶序列结合对模板有选择性-可进行多重PCR反应成本高-不同靶基因需要合成不同探针,染料法通用性好-对DNA模板没有选择性使用方便，成本低-仅需设计两个引物有假阳性现象-通过
8、融解曲线判断,Real-time PCR 应用,基因表达分析-相对定量：基因表达量的差异-绝对定量：样本中核酸的量（拷贝数、微克）基因型分析-SNP检测 等位基因检测 甲基化检测,基因表达分析检测,test sample处理样本,target gene目的基因,reference gene内参基因,total RNA,cDNA,calibrator sample对照样本,target gene目的基因,reference gene内参基因,qPCR,以各自样本中内参基因为标杆，比较两样本中目的基因的相对丰度。,数据分析,qPCR,内参基因的选择,特点,选择内参基因,内参基因,beta-acti
9、n、GAPDH、18S rRNA、28S rRNA等,-文献检索-实验筛选选择多个备选内参基因，以备选内参基因的几何平均数作为均一化标准,内参基因Housekeeping Gene,-RNA抽提、反转录为cDNA的效率不同，用于定量分析的样本初始浓度不同。,对样本初始浓度差异进行均一化校正。,不同环境，不同器官、组织、细胞类型之间，表达量相对恒定。,Housekeeping Gene 康为产品,不同丰度：高丰度 ACTB、GAPDH中等丰度 beta2M低丰度 HPRT1不同物种：人、大鼠、小鼠、猪、牛、羊、鸡、斑马鱼、甘蔗 等,基因表达分析检测,样本处理与 RNA提取 cDNA qPCR内参
10、基因(housekeeping gene)选择,样本处理与RNA提取,外界刺激 10分钟 可检测的表达改变样品离开定义环境 2分钟内 固定、裂解细胞RNA样本保存液 Trizol 超纯RNA提取试剂盒RNA的评价与鉴定-完整性-纯度 小心DNA污染！-使用DNase-引物设计-以RNA作PCR阴性对照,CW0580,CW0592,CW0581,CW2090A,RT-qPCR一步法还是两步法？,两步法：步骤多但灵活多样。cDNA可长期保留，检测多个基因，便于反应条件的优化。推荐：工作的初期阶段，以及单个样本多个靶基因检测。,一步法：简单、灵敏度高，有效减少实验操作误差和污染。每次只能做一个基因。
11、推荐：工作的成熟阶段，以及多个样本单个靶基因检测。,逆转录,逆转录引物选择下游应用：是否检测其它基因？Abundant RNA的干扰：mRNA or total RNA？检测灵敏度是否足够？逆转录酶SuperRT 逆转录酶（RNase H-）HiFi-MMLV逆转录酶（RNase H-）,CW0741,CW0743,总原则与普通PCR相同：避免引物二聚体，避免二级结构扩增片段长度（80 300 bp)推荐做跨intron设计,引物设计原则,反应条件优化,内参基因 目的基因-融解曲线：单一特异性产物-扩增曲线：Ct值-标准曲线：扩增效率尽量高，目的基因尽可能接近内参基因,反应条件优化,融解曲线分
12、析-单一特异性产物,将温度对荧光强度的变化求导,标准曲线分析,-扩增效率尽量高-目的基因尽可能接近内参基因 10%以内,反应条件优化,反应条件优化,扩增曲线分析-Ct值,Master Mix的应用,-热启动酶化学修饰，常温下完全没有聚合酶活性，热复活需95 10分钟-GoldStar、HotStar非化学修饰（Oligo修饰、抗体修饰、Mg2+螯合物）热复活仅需95几十秒-FastStar-Buffer反应增强剂-减少引物二聚体，进一步提高反应特异性-对于复杂模板，提高反应效率稳定剂-dNTP,Master Mix的应用,ROX Passive Reference不参与、不干扰PCR反应恒定发
13、射荧光信号用于校正因信号检测器到各孔间光路不同而导致的系统误差。需参照仪器要求选择。,误差控制使用Master mix配置预混体系设置生物学重复（不同个体）技术性重复（复孔）阴性对照,荧光定量PCR体系,2-Ct法,满足条件：1）内参基因和目标基因的扩增效率接近-正负10%2）内参基因和目标基因的扩增效率基本为90%-110%,相对定量数据分析,1、目标基因的CT值-内参基因的CT值2、待测样本的CT值-对照样本的CT值3、计算表达水平比率：2 CT=表达量的比值,Trouble shooting,荧光定量产品-染料法,FastSYBRMixture,UltraSYBR Mixture,Gol
14、dStar Taq特异性强灵敏度高Ct值更低线性范围更广定量更准确,反应速度快比普通反应可节省约40分钟适合于普通和快速定量PCR程序,荧光定量产品-染料法,某其它品牌 康为 UltraSYBR,-cDNA用内参actin引物进行扩增，产物片段100bp。-模板浓度进行10倍稀释，稀释6个梯度。,康为世纪产品,RNA-Trizol-超纯RNA提取试剂盒-动物组织RNA-植物RNA-血液RNA-病毒RNA 逆转录-SuperRT/HiFi-MMLV逆转录酶-cDNA第一链合成试剂盒-RT-PCR 一步法、两步法试剂盒荧光定量PCR-UltraSYBR Mixture-FastSYBR Mixture-GoldStar Taqman MixturePCR-GoldStar DNA Polymerase-Taq/Es Taq DNA Polymerase-Taq/Es Taq Master Mix,
