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1、药物筛选复习课,选择药物作用靶标的考虑因素,1 靶标的有效性，即靶标与疾病确实相关，并且通过调节靶标的生理活性能有效地改善疾病症状。2 靶标的副作用，如果对靶标的生理活性的调节不可避免地产生严重的副作用，那么将其选作药物作用靶标是不合适的。,从天然资源中寻找微生物先导药的一般流程,1.采集各种来源的样品2.根据不同的分离要求进行处理3.对各类微生物分离纯化4.分离菌株的培养、发酵5.应用各种模型对发酵产品进行高通量筛选6.对活性物质进行化学分离纯化及结构测定7.活性物质体内外活性评价8.先导化合物的结构优化及深入研发9.放大发酵积累量进行临床研究,影响微生物合成的主要因素,影响其合成效率的主要
2、因素有：所用微生物的种类、底物、酶、培养基类型、温度等。（一）微生物微生物种类不同，其代谢以及合成的产物的结构类型乃至生物活性多不相同，扩大微生物的来源是寻找新的微生物产物的有效途径之一（二）酶及底物由于生物合成酶的底物专一性较低，在其野生型菌株或阻断突变株的发酵过程中添加一些结构类似物可作为前体产生新的微生物产品（三）其他培养条件微生物体具有的合成能力在适宜其生长的条件下会增强，也会因改变培养基成分而随之 变化，当环境不利时则会抑制其合成。,微生物发酵法,发酵是利用未固定的微生物在发酵罐中生长来获得所需产品，能够进行批次性的生产；发酵罐通常为含微生物营养基的大槽或大桶。发酵罐常配有能够调节培
3、养基温度、pH和氧气含量的调节器；典型的培养基含碳源如葡萄糖、水合淀粉或果糖；蛋白质或氮源如大豆粉、玉米汤或棉籽粉；维生素源如酵母提取物；矿物质和其他混合性营养物。,初级代谢与次级代谢,一般将微生物通过代谢活动所产生的自身繁殖所必需的物质和能量的过程，称为初级代谢，该过程所产生的产物即为初级代谢产物，如氨基酸、核苷类，以及酶或辅酶等。微生物的初级代谢是指微生物从外界吸收各种营养物质，通过分解代谢和合成代谢，生成维持生命活动所需要的 物质和能量的过程。次级代谢与初级代谢关系密切，次级代谢是指微生物在一定的生长时期，以初级代谢的关键性中间产物为前体物质，合成一些对微生物的生命活动无明确功能的物质的
4、过程，这一过程的产物，即为次级代谢产物。次级代谢产物在微生物生命活动过程中的产生极其微量，对微生物本身的生命活动没有明显作用，当次级代谢途径被阻断时，菌体生长繁殖仍不会受到影响。,微生物固定法,细胞固定就是将微生物种在一个不溶的细胞性或非细胞性模块上，模块可以是合成的聚合物、生物聚合物或微生物体本身。微生物固定有 种常用的方法，包括在模块中诱导、模块上吸附、压缩入模块、与模块以共价键结合、细胞间的化学交叉结合以及絮凝，最常用的是诱导。,基因突变的种类,根据遗传信息的改变方式，可分为同义突变、错义突变和无义突变三种。同义突变：改变后的密码子和改变前的密码子是简并密码子，它们编码同一种氨基酸，这种
5、基因突变称为同义突变错义突变：由于一对或几对碱基对的改变而使决定某一氨基酸的密码子变为决定另一种氨基酸的密码子的基因突变叫错义突变。这种基因突变有可能使它所编码的蛋白质部分或完全失活无义突变：由于一对或几对碱基对的改变而使决定某一氨基酸的密码子变成一个终止密码子的基因突变叫无义突变。其中密码子改变为UAG的无义突变又叫琥珀突变，密码子改变成UAA的无义突变又叫赭石突变,基因突变的特点,1、基因突变在生物界中是普遍存在的2、基因突变是随机发生的。它可以发生在生物个体发育的任何时期和生物体的任何细胞3、在自然状态下，对一种生物来说，基因突变的频率是很低的4、大多数基因突变对生物体是有害的5、基因突
6、变是不定向的。一个基因可以向不同的方向发生突变，产生一个以上的等位基因,基因突变与药物靶标的发现及应用,在基因水平上寻找药物靶标过程：1 寻找疾病相关生物分子线索：利用基因突变技术获取疾病相关的生物分子信息，并进行生物信息学分析，获取线索。2 对相关的生物分子进行功能研究，以确定候选药物作用靶标。3 候选药物作用靶标，设计基因突变的DNA及其多肽在分子、细胞和整体动物水平上进行药理学研究。4 验证靶标的有效性。,What is a microarray?,Microarray 或 Biochip（生物芯片）是一种微型多参数生物传感器。它通过在一微小的基片表面固定大量的分子识别探针，或构建微分析
7、单元和系统，实现对化合物、蛋白质、核酸、细胞或其它生物组分准确、快速、大信息量的筛选或检测。A microarray is an ordered array of microscopic elements on a planar substrate that allows the specific binding of genes or gene products.,蛋白质芯片,蛋白质芯片是将各种蛋白质有序地固定在玻片、凝胶、微孔板等各种载体上形成密集蛋白质芯片，用来高通量地测定蛋白质的生物活性，如酶活性、蛋白质一蛋白质问及蛋白质一其它分子，如蛋白质一DNA、蛋白质一配基问的相互作用。,免疫共
8、沉淀(Co-Immunoprecipitation),免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其基本原理是:细胞裂解液中加入抗体，与抗原形成特异免疫复合物，经过洗脱，收集免疫复合物，然后进行SDS-PAGE及Western blotting分析。,特点,优点：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点为：缺点：（1）可能检测不
9、到低亲和力和瞬间的蛋白质蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。,放射免疫性检测(RIA，Radioimmunoassay）,放射免疫性检测(RIA，Radioimmunoassay)的基本原理是利用标记抗原(Ag*)和非标记抗原(Ag)对特异性抗体(Ab)发生竞争性结合，用已知不同浓度的标准物和一定量的Ag*及限量的Ab反应，采取一定方法将Ag*-Ab与Ag*分开，即可算出该标准物在各浓度下Ag*-Ab复合物的结合百分率。然后，
10、加入要筛选的目标物在标准曲线上即可查出样品中是否含有要筛选的目标物及其浓度。,亲和闪烁检测法Scintillation Proximity Assay,SPA,该技术使用能产生冷光的特制平板或圆球微粒，其底部或外层包被着连接分子，通过化学处理可使抗体、受体蛋白质和酶偶联到含闪烁的微球体（荧光微球体或SPA）的表面上，当其和同位素标记的配体特异性结合，近距离释放射线能量激发产生冷光，继而被探测器所监测；不能特异性结合的小分子，其标记同位素所发出的射线能量大部分被水溶液散射，而不足以激发产生冷光。可使用闪烁计数器方便地测定。,Homogeneous AssaysOne-pot assays wit
11、h no transfer or wash steps All the reagents are added in one step or in multisteps The signal is read in a plate readerHeterogeneous Assays多步筛选：multiple additions/incubations/washings/transfers/filtrations/readings of the signalLabor intensive,complicated step,hard to automate,SPR基本原理,它利用P偏振光在玻璃与金属
12、薄膜界面处发生全内反射时渗透到金属薄膜内的消失波,引发金属中的自由电子产生表面等离子体,当表面等离子体与消失波的频率相等时,二者将发生共振,界面处的全反射条件将被破坏,呈现衰减全反射现象，入射光被金属表面电子吸收,使反射光能量急剧下降,SPR的优点,待测物无需标记适用于混浊、不透明或者有色溶液能实时、连续监测反应动态过程检测方便、快捷应用范围广，检测灵敏度高始终保持生物分子的活性,SPR缺点,难以区分非特异性吸附对温度、样品组成等干扰因素敏感多步结合和多价结合的干扰空间位阻效应配体或者分析物的不均一扩散速度的限制重结合现象,SPR的应用,对生物分子进行识别及定量检测研究生物分子间的相互作用,用
13、SPR可获得的信息：两个分子之间结合的特异性目标分子的浓度结合以及解离过程的动力学参数结合的强度,报告基因检测,报告基因检测（report gene assay）报告基因(reporter gene)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。,报告基因的特点：(1)已被克隆和全序列已测定；(2)表达产物在受体细胞中不存在，即无背景，在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物；(3)其表达产物能
14、进行定量测定。,报告基因的种类,1、氯霉素乙酰转移酶2、半乳糖苷酶3、人生长激素4、荧光素酶5、荧光蛋白,荧光产生的原因,原子荧光光谱的产生气态自由原子吸收光源的特征辐射后，原子的外层电子跃迁到较高能级，然后又跃迁返回基态或较低能级，同时发射出与原激发波长相同或不同的发射即为原子荧光。原子荧光是光致发光，也是二次发光。当激发光源停止照射之后，再发射过程立即停止。,时间分辨荧光（HTRF）,一般荧光技术的缺点是荧RF光寿命短，背景荧光高，激发光和发射光容易相互干扰HTRF主要是利用碱土金属寿命长的特点，可以在激发和检测之间延缓一段时间，使具有不同荧光寿命的物质达到分别检测的目的。同时通过荧光谐振
15、能量传递原理，区分开激发光和发射光,荧光偏振（Fluorescence Polarization，FP）1926年Perrin首次在研究论文中描述他所观察到的荧光偏振现象。以一束单一波长的偏振光照射溶液中的荧光物质，后者可吸收并释放出相应的偏振荧光。如果被激发的荧光物质处于静止状态，该物质仍将保持原有激发光的偏振性，如果其处于运动状态，该物质发出的偏振光将区别于原有激发光的偏振特性，也就是所谓荧光去偏振现象。当荧光染料被单极光激发释放荧光，产生水平和垂直方向光束。水平和垂直方向光通量的比值即为偏振值（mP）。mP大小主要由荧光物质分子旋转速度决定，而旋转速度与分子大小呈反比。小分子荧光染料与其
16、他分子结合后，分子量增加而旋转速度降低，则荧光偏振值（Mp）升高；相反，如小分子荧光染料从已结合的分子上解离，则荧光偏振值降低。由于FP 直接检测水平和垂直方向光通量比值，Mp 值不受绝对荧光强度的影响，具有操作简单、快速；分析结果稳定；成本低、高通量和易于自动化等优点。,酶联免疫吸附(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗
17、原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。,双抗体夹心ELISA,1）将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。2）加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。3）加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。4）加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物
18、。通过比色，测知标本中抗原的量。在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原。,竞争性ELISA,当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，从而反映出抗体的量,PCR引物的设计原则总述,引物长度（primer length）产物长度（product length）序列Tm值(melting temperature)G+C含量（composition）引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin）阅读框,质粒的定
19、义,中文名称：质粒 英文名称：plasmid,质粒是一类存在于细菌和真菌细胞中，能独立于染色体DNA而自主复制的共价，闭合，环状DNA分子，其大小通常在1-100kb范围内。质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活，而宿主即使没有它们也可以正常存活。质粒的存在使宿主具有一些额外的特性,具有对受体细胞的可移植性或亲和性 具有与特定细胞相适应的复制位点和整合位点 具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点具有合适的选择性标记,一个理想载体应具备的条件,质粒的改造和构建：指导思想,删除不必要的DNA区域，尽量缩小质粒的相对分子质量，以提高外源DNA片段的装载量。灭活某
20、些质粒的编码基因，如促进质粒在细菌种间转移的mob基因，杜绝质粒扩散污染环境，保证DNA重组实验的安全加入易于识别的选择标记基因，最好是双重或多重标记，便于检测含有重组质粒的受体细胞。在选择性标记基因内引入具有多种限制性内切酶识别及切割位点的DNA序列，同时删除重复的酶切位点。根据外源基因克隆的不同要求，分别加装特殊的基因表达调控元件或用于表达产物亲和层析分离的标签编码序列。非结合型，即要求质粒不会从一个细菌转移到另一个细菌。,肿瘤的发生不仅是分裂失控导致的细胞过度增生，同时也可能是细胞凋亡通路受阻，使本该死亡的细胞继续存在而产生肿瘤，因此，选择性诱导肿瘤细胞凋亡为目标的技术已成为肿瘤治疗的重
21、要策略之一。细胞凋亡是存在于细胞中的自毁机制，细胞凋亡能够使机体清除衰老和异常的细胞，在维持许多细胞功能方面起到重要作用。1972年kerr等首先提出“细胞凋亡”这一概念，是由体内外因素触发的细胞内置的死亡程序诱导的细胞死亡过程。细胞凋亡是细胞在一定的生理或病理条件下，自己结束其生命的过程，具有严格的基因时控性和选择性。生物体各种细胞的数量都是通过增殖与死亡之间的平衡来完成的。,细胞周期,细胞周期指由细胞分裂结束到下一次细胞分裂结束所经历的过程，所需的时间叫细胞周期时间。G1期(gap1)，指从有丝分裂完成到期DNA复制之前的间隙时间。S期(synthesis phase)，指DNA复制的时期
22、，只有在这一时期H3-TDR才能掺入新合成的DNA中。G2期(gap2)，指DNA复制完成到有丝分裂开始之前的一段时间。M期又称D期(mitosis or division)，细胞分裂开始到结束。,微管的功能,细胞内，微管以胞质微管和纺锤体微管两种形式存在，主要参与细胞运动、细胞器的定位、胞内物质的运输及真核细胞的有丝分裂过程。细胞进入分裂期，其胞质微管解聚成微管蛋白后再组装成纺锤体微管。在分裂后期，纺锤体微管牵引着姊妹染色单体从赤道面移向纺锤体的两极。在有丝分裂结束后，纺锤体微管解聚再组装成胞质微管。,抗结核药物的筛选,What is 结核病?,结核病是由结核杆菌感染引起的慢性传染病。结核菌
23、可能侵入人体全身各种器官，但主要侵犯肺脏，称为肺结核病。是青年人容易发生的一种慢性和缓发的传染病。一年四季都可以发病，15岁到35岁的青少年是结核病的高发峰年龄。潜伏期48周。其中 结核杆菌80发生在肺部，其他部位(颈淋巴、脑膜、腹膜、肠、皮肤、骨骼)也可继发感染。人与人之间呼吸道传播是本病传染的主要方式。传染源是接触排菌的肺结核患者。,结核杆菌,当前抗结核治疗药物,Screening,临床常用治疗药物,当常规治疗失败后可使用二线抗结核药物,临床常用治疗药物及耐药靶点,一线抗结核药物作用靶点的突变使原有药物的作用蛋白构像发生了改变,利福平，异烟肼，链霉素，乙胺丁醇和吡嗪酰胺 这些药物不良反应多
24、、杀菌作用不强、疗程必须使用个月以上，患者依从性差。,卷曲霉素、乙硫异烟胺、对氨基水杨酸、环丝氨酸、环丙沙星、阿米卡星和卡那霉素不良反应较大，治疗时间更长（个月），花费昂贵，治愈率也更低,年我国总耐药率为，其中初始耐药率为.，获得性耐药率为.,抗结核药物新靶点,与胞壁合成相关的新靶点,01,与持留态有关的新靶点,02,与结核杆菌毒性相关的靶点,04,05,06,与核酸相关的靶点,03,与胞壁合成相关的新靶点-肌醇-1-磷酸合成酶,肌醇存在于分枝杆菌中,与其生长繁殖密切相关。肌醇是合成细胞壁的必须前体结核杆菌利用肌醇合成其体内主要的硫醇分枝硫醇。分枝硫醇在维持分枝杆菌的氧化还原平衡、保护细胞免受
25、氧化应激的伤害和半胱氨酸的保存方面起着重要的作用,对细菌的生长和毒力具有重要意义。肌醇在细菌体内合成的第一步是葡萄糖-6-磷酸在肌醇-1-磷酸合成酶(ino1,酶编号5.5.1.4)的催化下形成肌醇-1-磷酸。肌醇-1-磷酸合成酶基因突变的结核杆菌，在正常的培养基上无法生长。,肌醇-1-磷酸合成酶,故肌醇-1-磷酸合成酶可以作为抗结核药物的靶位，而由此产生的药物可能对结核杆菌具有较强的特异性。肌醇-1-磷酸合成酶也是真核生物中非常重要的多元醇。在设计和筛选结核杆菌肌醇-1-磷酸合成酶抑制剂的时候，应尽量避免抑制剂对真核生物的肌醇-1-磷酸合成酶产生抑制作用，影响人体的正常生理功能，从而产生药物
26、副作用。,磷酸肌醇合成酶抑制剂在37摄氏度下，0.5 mM 2-3H肌醇(12,000 cpm/nmol)(用3H标记)用CHCl3作溶剂，同时加入Tris-HC1(pH 8.3)48mM MgCl2,0.5 mM Ptd-CMP,0.25%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100),5 mM 类似物,和 0.05 mg 的微粒体蛋白，配置成0.1mL的溶液。反应20分钟后加入0.5 mL 的 0.1 N HCl（含有MeOH)和0.5mL of CHCl3。用0.5mL的水分离。有机质层的放射性用闪烁探测器来测定。,肌醇抑制剂放入F111细胞将F111细胞放入培养皿中培养一晚上，培养皿中
27、加入10%经透析的胎牛血清和10微克的肌醇。附着在玻盖上的细胞用Krebs-Ringer 缓冲液(135 mM NaC1,4.6 mM KC1,1.2 mM CaCl2,l mM 磷酸钠,1.3 mM MgSO4,5 mM HEPES pH 7.41）冲洗两次，然后浸在含有10 pM 3H】肌醇(l000 cpm/pmol)和5 mM 类似物中，放入含有5%CO2的恒温箱恒温在37摄氏度。120分钟后将细胞用140mM NaCl冲洗六次，一份溶解在1%SDS中，另一份溶解在10%三氯乙酸中，然后离心分离。最后细胞溶解液在闪烁探测器中测定放射性，用蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白质。,与毒性有关的靶点
28、-泛酸合成酶,泛酸是一种B族维生素(Vit&)，它是辅酶A(CoA)和酰基载体蛋白(ACP)的生物合成的关键前体，CoA和ACP分子结构中的磷酸泛酰巯基乙胺来源于泛酸；CoA和ACP参与生物体内碳水化合物、脂肪酸、蛋白质和能量代谢，是细胞生长过程中重要的辅因子；阻断泛酸的合成将抑制结核杆菌的生长。此外，泛酸的生物合成对于结核杆菌的毒性也是至关重要的，敲除泛酸合成酶基因panC和panD所得的泛酸营养缺陷型菌株毒性比卡介苗还低。并且，微生物和植物都必须通过自身生物途径合成泛酸，而哺乳动物自身不能合成泛酸，必须从食物中获得。因此，泛酸合成途径是一个理想的抗结核药物作用靶点。,结核杆菌泛酸合成途径中
29、，主要有4个酶参与反应，酮泛解酸羟甲基转移酶(PanB),泛酸合成酶(PanC)L-天冬氨酸-脱羧酶(PanD)和酮泛解酸还原酶(PanE),四种酶协同催化下完成的。它们分别由panB、panC、panD和panE编码。这其中泛酸合成酶(pantothenatesynthetase，IX3)是关键的限速酶，催化泛酸合成的最后一步反应，因此，泛酸合成酶成为抗结核药物合适靶位。,筛选方法,建立泛酸合成酶活力的测定方法：原理是泛酸合成酶催化反应得到的产物之一为AMP,AMP可反应得到ADP,ADP和磷酸烯醇式丙酮酸钾作用生成丙酮酸，丙酮酸生成乳酸消耗NADH,还原态的NADH在340nm有吸光，而氧
30、化态的没有。由分光光度计测吸光度的变化，从而测定泛酸合成酶活性。,与核酸相关的靶点DNA回旋酶,DNA回旋酶，又称促旋酶，旋转酶。属拓扑异构酶II(type II），它的作用是在水解ATP的同时能使松弛态环状DNA转变为负超螺旋DNA,与细菌体内DNA转录复制重组和修复等生理过程密切相关。DNA拓扑异构酶（DNA topoisomerase）为催化DNA拓扑学异构体相互转变的酶之总称。催化DNA链断开和结合的偶联反应，为了分析体外反应机制，用环状DNA为底物。在闭环状双链DNA的拓扑学转变中，要暂时的将DNA的一个链或两个链切断，根据异构体化的方式而分为二个型。切断一个链而改变拓扑结构的称为型
31、拓扑异构酶（top-oisomerase），通过切断二个链来进行的称为型拓扑异构酶（topoisomerase）。,超螺旋是DNA三级结构DNA在二级结构双螺旋的基础上，进一步扭曲、折叠，螺旋形成超螺旋的三级结构。螺旋变紧的称为正超螺旋，变松的称为负超螺旋。这是DNA三级结构的一种常见形式。,酶活性测定 在缓冲液中，加入超螺旋PcDNA质粒及回旋酶酶提液和不同浓度的药物(设空白对照组及加酶不加药对照组)，混匀后，37温孵30 min。加入及蛋白酶K。中止反应；继续于37温孵30min后，加入溴酚蓝；点样于08琼脂糖凝胶板，在70 V电压下电泳1 h，以溴化乙啶(EB)溶液染色至少30 min，
32、置凝胶成像系统中观察结果并照像记录。,以异柠檬酸裂解酶（ICL）为靶点,异柠檬酸裂解酶（isocitrate lyase，ICL）是乙醛酸循环途径中的关键限速酶之一，研究表明异柠檬酸裂解酶对于持留结合杆菌的存活起关键作用，决定了结核杆菌的持留性，最终导致结核病疗程过长。敲除了ICL基因的结核分支杆菌不再具有持留性。而人等高等动物中不存在乙醛酸代谢途径。,筛选模型的建立 以D（s）型异柠檬酸作为底物，利用ICL参与的酶促反应产物（乙醛酸和苯腙反应后的复合物）在324nm处有吸收的特性，测定25酶促反应体系在324nm处吸光度的变化，即可测得异柠檬酸裂解酶的活力。异柠檬酸裂解酶可催化底物异柠檬酸产
33、生琥珀酸和乙醛酸，产物乙醛酸可与苯肼反应生成苯腙，苯腙在324nm波长下产生光吸收峰，因此测定酶促反应体系在324nm波长下光吸收的变化即可测定异柠檬酸裂解酶的酶活力。,以蛋白激酶G为靶点的筛选,研究表明，结核分枝杆菌（MTB）自身基因组内的pknG基因所编码的蛋白激酶G（PknG）对持留状态的形成起着关键性的作用。当MTB被巨噬细胞吞噬，形成吞噬体厚，PknG可以阻止吞噬体与细胞内溶酶体的融合，从而使MTB在细胞内免于被溶酶体的水解酶类降解。,-糖尿病治疗的作用靶点,1.定义：糖尿病是一组由于胰岛素分泌缺陷及（或）其生物学作用障碍引起的高血糖为特征的某些疾病。慢性高血糖常导致各种脏器，尤其是
34、眼、肾、神经及心血管的长期损害、功能不全和衰竭2.分类：1型（B细胞被破坏，常导致胰岛素绝对缺乏）2型（胰岛素抵抗或分泌缺陷）特异型妊娠,胰岛素受体广泛分布于全身各组织细胞膜。约有l，000300，000个受体，大多数含有1万个受体。胰岛素受体是糖蛋白，由2个a和2个B亚基即a2b2构成。胰岛素受体是由位于第19号染色体短臂上的IR基因，a和B亚单位是由单个基因所编码的，seino等发现IR基因是120kb，22外显子。11个外显子编码a亚单位，共90多个kb，11外显子编码B亚单位，共30多个kb。三个转录起始点定位于翻译起始点的上游276bp，282bp和283bp。不同组织胰岛素受体存在
35、着异质性。,蛋白质激酶在与细胞生长、分化和增值有关键作用的信号级联中担当着管理者的角色。这些酶在底物特定的蛋白位点将磷酸基团转变成ATP。PI3K家族被认为是控制细胞这些进程的长官。一些外部的细胞生长因子，比如表皮生长因子受体，胰岛素受体和G蛋白偶联受体，信号的传递直接通过PI3K。族PI3K根据其活性机制被分成两种亚基，A和B。PIP3连接着许多有用的分子，比如丝氨酸-苏氨酸激酶、酪氨酸激酶和G蛋白管理者。这些分子控制着细胞的生长和增值，防止凋亡，调控胰岛素的新陈代谢。被PI3K控制的蛋白质的显著的生物学功能识别了PI3K作为发展治疗癌症、糖尿病和炎症、免疫疾病的强有力的靶点。,Ribbon
36、 representation of the crystal structure of Phosphatidylinositol 3-kinase(PI3K)SH3 domain and an artificial peptide complex,原理：小分子能作为电子或能量的猝光剂，成百上千的聚合物重复单元小分子PRUs(polymer repeat units)可以熄灭荧光。The PRUs are conjugated to form a background of modified anionic polyelectrolyte poly derivatives,in which un
37、saturated electrons form strong absorption bands and convey to the material the properties of semiconductors.,已知在葡萄糖稳态中的作用GK在所有的己糖激酶同工酶中是独一无二的。它是一个50kDa的分子单体。它的葡萄糖半饱和浓度大约是7.0mmol/L，此时共底物MgATP在生理学水平上饱和。这个酶显示出S型的葡萄糖依赖，并且在葡萄糖浓度约4.0mmol/L改变时最敏感。,过氧化物酶体增殖激活受体(peroxisome proliferator-activated recepotor，P
38、PARs).。PPARs是一类由配体激活的核转录因子，属于型核激素受体超家族，包括由不同的基因编码的3种亚型PPAR，PPAR和PPAR，能调节食入脂肪的储存和代谢.可以通过与靶基团启动区内的过氧化物酶体增长因子反应元件(peroxisome proliferator response elements，PPREs)结合而调控基因表达，与许多生理和病理过程如能量平衡、细胞分化、脂质代谢、糖尿病、动脉粥样硬化、肿瘤等相关。,Nde,Sal,hPPARc,mCBP,Nde,Sal,锂醋酸盐转化法,必须在同时缺乏Trp&Leu环境下生长,Upstream genes,MEL1 gene(the GAL),BD,PPAR,mCBP,AD,transcription,AgonistAntiagonist,-Gal,PNP-,
