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1、2.6 蛋白质的分离、纯化,研究蛋白质的结构、性质和功能，首先需要得到纯的蛋白质样品。(1)蛋白质来源：微生物细胞、动物细胞和植物细胞；(2)随时测定蛋白质活性并检测蛋白质含量。(3)分离和纯化过程都必须在温和的条件下进行。,一、蛋白质分离纯化的一般原则,(1)生物组织的机械破碎。常用的方法有研磨法、超声波法、冻融法和酶解法等。(2)根据蛋白质的特性，选择不同的溶剂进行抽提。水溶性蛋白用中性缓冲溶液抽提，酸性蛋白用稀碱性溶液抽提，脂溶性蛋白用表面活性剂抽提等。(3)粗提:离心除去固体杂质后，可通过沉淀法、超滤法、萃取法等处理，得到蛋白质粗制品。(4)精制：可用层析法、电泳法等进行精制。(5)成
2、品加工：测定蛋白质的性质并干燥成成品。,蛋白质的分离步骤,四、蛋白质的纯化方法,根据蛋白质的亲水胶体性质，当其环境发生改变时，蛋白质会发生沉淀作用(Precipitation)。因为蛋白质分子量大小不同、表面所代电荷不同、表面的亲水和疏水区域不同，所以可以通过可逆沉淀法将蛋白质分离出来。沉淀法具有部分纯化、浓缩特点。,(1)沉淀法,蛋白质的纯化方法,蛋白质的纯化方法,蛋白质在高浓度的中性盐溶液中，由于水化层被破坏和表面电荷被中和，容易发生沉淀阴离子化合物的效果是：NH4+K+Na+阳离子化合物的效果是：PO43-SO42-Cl-常用的盐为硫酸铵。不同的蛋白质由于所带的电荷和水化程度不同，盐析时
3、所需的盐的浓度也不相同，因而可以将不同的蛋白质加以分离。,(1)沉淀法,盐析,蛋白质的纯化方法,在蛋白质溶液中，加入一定量的与水互溶的有机溶剂，由于这些溶剂与水的亲和力强，能够破坏蛋白质的水化层，使蛋白质的溶解度降低而沉淀。常用的有机溶剂有乙醇、甲醇和丙酮等。为了防止蛋白质在分离过程中发生变性，有机溶剂浓度不能太高(30%-50%)，而且需要在低温条件下进行。5，25乙醇沉淀卵清蛋白。,(1)沉淀法,有机溶剂沉淀法,蛋白质的纯化方法,蛋白质分子在等电点时，净电荷为零，分子之间的静电排斥力最小，因而容易聚集形成沉淀。当蛋白质混合物溶液的pH 被调到某一成分的等电点时，则该蛋白质大部或全部将沉淀出
4、来。而那些等电点高于或低于该pH 的蛋白质仍然留在溶液中。该法适用于在等电点pH稳定的蛋白质。,(1)沉淀法,等电点沉淀法,蛋白质的纯化方法,Dialysis此法是利用蛋白质分子不能透过半透膜，而使它与其它小分子化合物，如无机盐、单糖、双糖、氨基酸、小肽以及表面活性剂等分离。常用的半透膜有玻璃纸或高分子合成材料，截止分子量一般为一万。,（2）膜分离法,透析法,蛋白质的纯化方法,透析是将待纯化的蛋白质溶液装在用半透膜制成的透析袋内，再将透析袋放入透析液（通常是蒸馏水或缓冲液）中进行透析。通透动力为半透膜两侧的物质浓度差。,（2）膜分离法,透析法,蛋白质的纯化方法,超过滤技术是在一定的密封容器，施
5、加一定压力使一定分子量的物质透过超滤膜。其中包括有：中空纤维超滤器、圆筒式超滤器板式超滤器。,（2）膜分离法,超过滤法,蛋白质的纯化方法,离子交换层析法,（3）层析法,蛋白质的纯化方法,此法又称为分子筛层析（gel-filtration chromatography）。凝胶过滤所用的介质是由交联葡萄糖、琼脂糖或聚丙烯酰胺形成的凝胶珠。凝胶珠的内部是多孔的网状结构。Sephadex-葡聚糖凝胶G10-G200Sepharose-琼脂糖凝胶2B,4B,6BSephacryl-丙烯酰胺葡聚糖凝胶S100,S200,S300,S400,凝胶过滤法,（3）层析法,分子筛层析（gel-filtration
6、 chromatography）,原理,基质 葡聚糖凝胶（sephadex）琼脂糖凝胶（sepharose）,应用 测定分子量:lgMr=a-bVe 脱盐和浓缩 分离提纯生物大分子,这是一种高效分离纯化蛋白的方法。其原理是不同的蛋白质分子对于固定化在载体上的特殊配基具有不同的识别和结合能力。选择与待纯化蛋白质具有特殊识别和结合作用的配基，然后应用化学方法将该配基与载体共价连接。将这种连接有配基的载体装入层析柱中。当含有待纯化的蛋白质溶液通过层析柱时，该蛋白质即与配基发生特异性结合而被吸附在层析柱上，而其它蛋白质则流出柱外。被特异性结合在层析柱上的蛋白质，可以用适当的配体洗脱液洗脱。,亲和层析法
7、,（3）层析法,亲和层析（affinity chromatography）,应用 分离纯化酶、抗原、抗体 分离纯化核酸 研究酶的结构与功能,原理：,基质 纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、sepharose、sephadex,蛋白质的纯化方法,在外电场的作用下，带电颗粒将向着与其电性相反的电极移动，这种现象称为电泳。蛋白质溶液的pH值不等于等电点时，蛋白质颗粒均带有不同的电荷。由于不同蛋白质的分子量不同，所带的电荷不同，因而在电场中移动的速度也不相同。在外加电场作用下，带电的蛋白质颗粒在电场中移动的速度（v）取决于电场强度(E)，所带的净电荷(q)以及与介质的摩擦系数(f)。,（4）电泳法,蛋白质的纯化
8、方法,SDS（十二烷基磺酸钠）是一种阴离子型表面活性剂，它能够与蛋白质多肽链中的氨基酸残基按大约1 2比例结合。这样，每一个蛋白质分子都因为结合了许多的SDS而带有大量的负电荷，而蛋白质分子原有的电荷则可以忽略。由于所有的蛋白质颗粒都带有大量的负电荷，而且它们的电荷密度也大体相同，因此，Eq值接近一个常数。所以该法主要利用了蛋白质分子量大小不同而分离蛋白质。用已知分子量的蛋白质作为标准，则可以估算出不同蛋白质的分子量。,（4）电泳法,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法,离心技术,1离心机类别 普通离心机 6000转/分 高速离心机 2-3万转/分 超速离心机 3万转/分,2沉降系数（S）概念,沉降系
9、数（S）,生物大分子在单位离心力场作用下的沉降速度称为沉降系数。即沉降系数是微颗粒在离心力场的作用下，从静止状态到达极限速度所需要的时间。其单位用Svedberg，即S表示，S=110-13秒。,沉降系数（S）与分子量（M）的关系,Svederg方程:,五、蛋白质含量的测定,定氮法：灵敏度较低双羧脲法：样品量Folin-Lowry法：在碱性条件下磷钼酸、磷钨酸混合试剂与酪氨酸上的酚发生反应，生成蓝色化合物，将其与双羧脲法结合起来，蛋白质形成两种颜色的混合物老绿色，在650nm具有特定的吸收。灵敏度较高25g-250g/ml.,考马斯亮蓝法（Bradford法）考马斯亮蓝G250是一种带有负电荷的染料，在酸性条件下，可与蛋白质上的正电荷结合，形成蓝色化合物，在595nm具有特定吸收，反应简便、快速、灵敏度高，5-50 g/ml。,紫外吸收法由于核酸在260nm具有光吸收，对测定干扰较大，可采用280nm、260nm同测法。蛋白质浓度mg/ml,蛋白质纯度等的测定,纯度和分子量的测定：采用电泳（如聚丙烯酰胺凝胶电泳，梯度凝胶电泳等）、高速离心、分子筛层析、高效液相色谱等技术测定。等电点的测定：利用等电聚焦方法测定。亚基个数的测定：采用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳方法测定。,
