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1、制曲过程中微生物菌种筛选与性能鉴定 指导老师：学生姓名：学号：,大曲是白酒生产过程中的糖化剂、发酵剂，是白酒发酵生产中微生物及酶的主要来源，大曲的质量直接关系到酒的出酒率及基酒的质量。,1 研究或解决的问题 本课题拟从不同时间段的大曲样品中分离获得各类微生物，对各类微生物进行计数；根据各类微生物特定的菌落形态进行分离，同时对菌种进行筛选；分析大曲微生物在不同时间段种类的变化和微生物数量的变化；在传统微生物鉴定方法的基础上，采用BIOLOG自动微生物鉴定仪来进行微生物的性能鉴定，通过比较两者的优劣来确定对微生物性能鉴定的最有效的方法；同时在分离和纯化过程中探讨如何更好地培养微生物。2 实验材料与
2、方法2.1 材料 跟踪取样的单粮型大曲（纯小麦）,2.2 实验仪器与设备 高压灭菌锅、超净工作台、电热恒温培养箱、振荡器、电子天平、酸度计、电磁炉、温度计、冰箱、恒温水浴锅、移液管（5mL，1mL）、试管、烧杯、玻璃棒、吸耳裘、无菌培养皿、涂布器、接种环、250mL锥形瓶、5mL刻度吸管、1mL刻度吸管、BIOLOG自动微生物鉴定仪。2.3 培养基及试剂 牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁培养基、孟加拉红培养基、BIOLOG自动微生物鉴定仪的特定培养基。,2.4 实验步骤2.4.1 操作流程 培养基配制 灭菌 取样 样品悬浮液配制 接种 分离和纯化 菌种筛选 接种 鉴定2.4.2 操作要点（1）培养基
3、的配置 根据培养基配制的要求进行。（2）灭菌 在实验过程中所有的器皿和相关设备要进行高温杀菌。同时在实验进行时，要在无菌状态下进行。（3）根据制作大曲的生产周期，跟踪取样8次，每次取大曲表层和曲心的混合样，每次取二个样品（不同库房内取一次），成型入库前取未湿润的原料一次和湿润的原料一次。,（4）浮液配制 无菌条件下，取5g样品，加入50mL无菌水，充分摇匀，自然沉淀后取上清液，得到10-1稀释样。然后依次制成10-2-10-7稀释样。（5）分离 酵母菌的分离 将增殖培养液作适当稀释，取0.5mL注入培养基琼脂平皿上，用玻棒均匀涂布，于30培养48h，根据菌落特征及镜检确认为酵母菌后，挑取单菌落
4、，平板划线法纯化，纯菌株移入斜面，备用。细菌的分离 将增殖培养液作适当稀释，取0.5mL注入培养基琼脂平皿上，用玻棒均匀涂布，于37培养23d，根据菌落特征及镜检确认为细菌后，挑取单菌落，平板划线法纯化，纯菌株移入斜面，备用。霉菌的分离 分离同酵母的分离一样,（6）BIOLOG 微生物鉴定操作步骤微生物的纯培养 用于鉴定的微生物必须为纯培养物,可将菌种分离纯化获得单菌落,使用菌落放大灯观察菌落形态判断是否为纯培养物。富集培养 微生物富集培养必须用BIOLOG专用培养基BUY培养基菌悬液制备（a）取无菌棉签在接种液中蘸湿。（b）将棉签在菌落表面滚动,粘取菌体,注意不要带出培养基。（c）在接种液管
5、液面上沿内壁转动棉签,使菌体附着在内壁上,同时将菌体均匀打散。（d）倾斜接种液管,用棉签将菌体分散于接种液中。如果有小的菌团,应使之沉到管底。,调整浊度(a)关闭浊度计电源,调整指针至“0”刻度;(b)用吸水纸擦干净空白接种液管外壁,置于浊度计中,接通电源,调整指针至100%T；(c)使用YT浊度标准品检查浊度仪的准确性,并调整至47%T；(d)擦干菌悬液管外壁,插入浊度计,读取菌悬液浊度值；(e)通过添加菌体或空白接种液调整浊度值,使其在相应标准浊度值的3%范围内。微平板的接种与培养（a）微平板的接种 将制备好的菌悬液倒入加样槽中,使用八道电动移液器,将其接种于微平板的96孔中。（b）微平板
6、的培养 盖上微平板盖,标上菌株编号,放置于大小适宜的托盘中,保持一定的湿度,可将1块湿毛巾垫于托盘底部来保持湿度。,2.5 实验结果2.5.1 制曲过程大曲温度变化动态 记录每天的气温和每个取样库房里面的温度，观察温度的变化趋势。2.5.2 制曲过程中细菌类的数量变化 采用平板菌落计数的方法：将待测样品经适当稀释之后,其中的微生物充分分散成单个细胞,取一定量的稀释样液接种到平板上,经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。计数步骤：编号稀释取样倒平板计数,编号 取无菌平皿和盛有无菌水的试管，对其进行编号 稀释 用1ml无菌吸管吸取1ml已经充分
7、混合均匀的菌悬液，精确地放0.5ml至10-1的试管中，此为10倍稀释。依次稀释，得到不同梯度的菌悬液。取样 用无菌吸管吸取菌悬液，对号放入编号的无菌平皿中。计数 培养一段时间后，取出培养平板，算出同一稀释度上菌落平均数，并按下列公式进行计算：每毫升中菌落形成单位（cfu）=同一稀释度重复的平均菌落数稀释倍数5,2.5.3 大曲理化指标随取样天数的变化2.5.3.1 水分的测定（1）测定方法 采用烘箱干燥法，准确称取试样10g,放入事先烘干、恒重的6080mm培养皿中，在130烘箱中烘烤45分钟后在干燥器中冷却30分钟称重。（2）计算 水分（%）=（M1-M2）100（M1-M0）式中：M0空
8、培养皿重（g）M1烘干前培养皿重（g）M2烘干恒重后试样加培养皿重（g）,2.5.3.2 酸度测定（1）测定方法 称取10g大曲于250mL烧杯中，准确加水100mL，于室温浸泡30分钟，每隔10分钟搅拌一次，用脱脂棉过滤，吸取滤液10mL，加水10mL、2滴0.1%酚酞指示剂，用0.1moL/L NaOH溶液滴定至微红色10秒不变色为止。（2）计算 酸度定义：10g大曲消耗氢氧化钠溶液的毫克当量数，即消耗1mg当量数氢氧化钠溶液为1度。酸度=CV（100/10）式中：C NaOH溶液的摩尔浓度（moL/L）V 消耗氢氧化钠溶液的体积（mL）100/10 为10mL大曲浸出液换算成100mL大曲浸出液的倍数。,2.5.4 大曲微生物性能的鉴定 利用BIOLOG微生物自动鉴定系统鉴定大曲中细菌类、酵母菌类、霉菌类的性能，对鉴定结果进行分析。对结果进行鉴定需要考虑3个参数：可能性(Probability)、相似性(Similarity)、位距(Distance)。SIM和DIS是2个重要的参数，表示测试结果与数据库相应的数据的匹配程度。当DIS5.0，SIM0.75为良好的匹配；SIM值越接近于1，检定结果的可靠性越高。,感谢各位老师观赏！,
