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1、第八章 酶定向进化,天然酶的局限,天然酶的稳定性差,活性低使催化效率很低,还缺乏有商业价值的催化功能天然酶的局限性源于酶的自然进化过程.,现代生物工程的要求,能具备长期稳定性和活性能适用于水及非水相环境能接受不同的底物甚至是自然界不存在的合成底物能够在特殊环境中合成和拆分制作新药物或药物的原材料如何利用相对简单的方法以达到对天然酶的改造或构建新的非天然酶就显得非常有研究意义和应用前景.,1993年,美国科学家Arnold F H首先提出酶分子的定向进化的概念,并用于天然酶的改造或构建新的非天然酶.,酶分子定向进化,简称酶定向进化，是模拟自然进化过程（随机突变和自然选择），在体外进行酶基因的人工
2、随机突变，建立突变基因文库，在人工控制条件的特殊环境下，定向选择得到具有优良催化特征的酶的突变体的技术过程。,酶定向进化的基本过程,随机突变、构建突变基因文库、定向选择酶定向进化的基本过程：,酶基因,随机突变,构建突变基因文库,筛选,负突变基因,正突变基因,进化酶,反复进行,第一节 酶定向进化的特点,1.适应面广不需了解酶的结构信息，因此称为非理性化设计。2.目的性强 3.效果显著,第二节 酶基因的随机突变,体外随机突变的方法：PCR技术、DNA重排技术、基因家族重排技术基因随机突变方法的特点P207表81,一 易错PCR技术,可以通过提高镁离子浓度、添加一定浓度的锰离子、改变4种底物（dAM
3、P、dTMP、dCMP、dGMP）的浓度比等反应条件，使DNA聚合酶在催化基因扩增时，增加碱基配对错误的出现频率，而引起基因突变。,特点,正突变的概率低，突变基因文库较大，文库筛选的工作量大，一般适用于较小基因的定向进化。,实例,枯草杆菌蛋白酶:洗涤剂合成、鞣革和医药领域的重要工业酶制剂。Chen 等采用易错PCR 对该酶进行了体外进化研究。他们通过降低反应体系中dATP 的浓度,对编码该酶从第49 位氨基酸到C 端的DNA 片段进行易错PCR,经筛选得到的几个突变株在高浓度的二甲基甲酰胺(DMF)中酶活性明显提高突变体PC3 在60%的DMF 中,酶活力是野生型的256 倍。将PC3 再进行
4、两个循环的定向进化,得到的突变体13M酶活力比PC3 还要高3 倍。,二 DNA重排技术,概念：又称为DNA改组技术，是从正突变基因文库中分离得到的同源DNA，用酶切割成随机片断，经过不加引物的多次PCR循环，使DNA的碱基序列重新排布而引起基因突变的技术过程。,DNA重排技术的基本过程,两条以上正突变基因,DNA随机片断,突变基因,构建突变基因文库,筛选,负突变基因,正突变基因,进化酶,酶切,（反复进行）,无引物PCR,基因重组,酶切,三基因家族重排技术,又称为基因家族改组技术，是从基因家族的若干同源基因出发，用酶(DNase)切割成随机片断，经过不加引物的多次PCR循环，使DNA的碱基序列
5、发生重新排布而引起基因突变的技术过程。,基因家族重排技术的基本过程,基因家族若干同源基因,酶切,DNA随机片断,突变基因,突变基因文库,基因重组,筛选,负突变基因,正突变基因,进化酶,无引物PCR,酶切,反复进行,DNA家族重排技术与DNA重排技术的异同点,相同点：DNA家族重排技术与DNA重排技术的过程大致相同，都要经过基因的随机切割、无引物PCR等步骤以获得突变基因，然后经过构建突变基因文库、采用高通量筛选技术筛选获得正突变基因。不同点：DNA家族重排技术从基因家族的若干同源基因出发进行DNA序列的重新排布，而后者则从采用易错PCR等技术所获得的两个以上的正突变基因出发进行DNA序列的重新
6、排布。,第三节 酶突变基因的定向选择,突变基因的定向选择基本过程,突变基因,基因载体,突变基因文库,基因重组,筛选,目的基因,一、构建突变基因文库的主要过程,载体的选择1）质粒载体：微生物细胞染色体外，闭合环状双链DNA分子。2）噬菌体DNA载体：由噬菌体DNA改造而成的具有自我复制能力的载体。3）黏粒载体：是一类人工构建的含有DNA黏性末端和质粒复制子的质粒载体，又称为柯斯质粒。4）噬菌粒载体：是一类人工构建的由M13噬菌体单链DNA的基因间隔区与质粒载体结合而成的基因载体。,基因重组,在体外通过DNA连接酶的作用，将基因与载体连接在一起形成重组DNA的技术过程。黏性末端连接平头末端连接修饰
7、末端连接,形成基因文库,将重组DNA转入受体细胞或包装成有感染活性的噬菌体的过程。重组质粒载体：转化重组噬菌体DNA载体：需要用噬菌体外壳蛋白将重组DNA进行包装，称为有感染活性的重组噬菌体，而形成基因文库。,二、突变基因的筛选,（一）定向选择环境条件的设定（1）提高酶的稳定性，高温筛选重组细胞，每一次突变筛选的循环中逐步提高重组细胞的培养温度。（2）如果定向进化的目的是提高内酰胺酶的活性，从而提高对内酰胺酶类抗生素的耐受性，可以通过在含有一定浓度的内酰胺酶类抗生素的培养基中培养重组细胞，并在每一次突变筛选循环中逐步提高抗生素的浓度。（二）高通量筛选技术P217表82,1.平板筛选法,平板筛选
8、法所依据的重组细胞的表型包括细胞生长情况、颜色变化情况、透明圈情况。1）依据细胞生长情况筛选突变基因 在提高酶的热稳定性、抗生素耐受性、pH稳定性和对其他极端环境条件的耐受能力等方面有广泛应用。,2）依据颜色变化筛选突变基因,（1）在采用噬菌体DNA载体构建突变基因文库时，可以用大肠杆菌半乳糖苷酶的基因片断（lacZ）插入到噬菌体DNA的间隔区域中，当它感染了相应的大肠杆菌宿主细胞时，在含有IPTG和底物Xgal的平板培养基上可以形成蓝色噬菌斑。（2）在对磷酸酯酶进行定向进化的过程中，可以在平板培养基中加入硝基酚磷酸，接种重组细胞培养一段时间后，有些重组细胞周围出现黄色（硝基酚）。,3）依据透
9、明圈情况筛选突变基因,依据透明圈情况筛选突变基因是在平板培养基中加入目的酶的作用底物，然后接种重组细胞，在一定条件下进行培养，培养一段时间后，在一些重组细胞的菌落周围会出现较大的透明圈。,自 学,2.荧光筛选法 3.噬菌体表面展示法 4.酵母细胞表面展示法,第四节 酶定向进化的应用,P221表83，总结应用一、提高酶的催化效率二、增加酶的稳定性三、改变酶的底物特异性,提高酶分子的催化活力,例如，吉林大学分子酶学工程教育部重点实验室张今教授课题组对L天冬氨酸酶，进行定向进化研究、以提高催化活力。,实例：L天冬氨酸酶定向进化研究,根据定向进化的基本思想，作者确定了易错PCR一筛选一(优势突变重组一筛选)n的实验路线。共进行了4轮易错PCR，每一轮易错PCR约筛选了3000个菌落。最终得到了一株酶活力提高28倍的突变体。对天然酶和进化酶的酶学性质进行了分析，结果表明进化酶的pH稳定性和热稳定性均优于天然酶，因此更适合于工业化生产L天冬氨酸。,枯草杆菌蛋白酶E热稳定性的分子进化（Huimin Zhao等，1999）,思考题,1 何谓酶的定向进化？有何特点？2 酶基因随机突变的三种方法？3 易错PCR技术的概念及其主要过程。4 DNA重排技术的概念及其主要过程。5 基因家族重排技术及其主要过程。,
