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1、,第七章 酶联免疫分析法,第七章 酶联免疫分析法,基本要求：了解免疫分析发展史，掌握抗原、抗体和免疫反应的原理，了解免疫分析法的分类，熟悉酶标记免疫分析法中使用的酶，熟悉ELISA的原理，掌握ELISA的固相载体、包被与封闭、稀释液、洗涤液、酶反应终止液及ELISA法常用酶的底物系统，掌握ELISA的酶联方法和试验方法，熟悉ELISA反应条件的选择，掌握ELISA的定量计算，了解ELISA的灵敏度提高途径，熟悉ELISA放大系统。了解化学发光分析的原理，熟悉化学发光剂的种类，熟悉化学发光酶联免疫分析常用的标记酶和发光增强剂，熟悉生物发光酶联免疫分析常用的生物发光反应体系。,第七章 酶联免疫分析
2、法,第一节 酶联免疫分析概述第二节 光度酶联免疫分析第三节 发光酶联免疫分析,第一节 酶联免疫分析概述,一、免疫分析1、免疫分析发展史免疫分析（Immunoassay，IA）是利用待测物质（抗原或抗体）与其相对应物质（抗体或抗原）之间专一特异性反应而建立起来的一种高选择性分析方法。免疫分析主要基于用抗体（或抗原）作为选择性化学试剂以分析测定抗原（或抗体）及半抗原。宋代 人工痘苗预防烈性传染病天花1971年 第一届国际免疫学会议 将免疫学与微生物学分开发展成一门独立的学科。,“免疫（immunity）”一词源于“immunitas”，原意是免除税赋和差役。研究早期免疫学多集中在抗体抗感染能力研究
3、。20世纪中期以后，人们逐渐开始对各种抗原、微生物的作用进行研究，发展出基础免疫学、临床免疫学、免疫学检测、医学免疫学等多个分支。现代免疫学将“免疫”定义为：机体对“自己”和“异己”识别、应答过程中所产生的生物学效应的总和，正常情况下是维持内环境稳定的一种生理性功能。,第一节 酶联免疫分析概述,2、抗原、抗体与免疫反应抗原是能够引起免疫反应的分子。免疫原性（immunogenicity）指诱导刺激免疫系统产生抗体或致敏淋巴细胞的能力。具有免疫原性的物质称为免疫原（immunogen）。免疫反应原性（immunoreactivity）或抗原性（antigenicity），指能与相应抗体或致敏淋巴
4、细胞发生特异性结合，引起免疫反应的性能。具备上述两种特性的物质为完全抗原，仅具有免疫反应性的物质被称为半抗原（hapten）。,第一节 酶联免疫分析概述,抗体是能与抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。所有的抗体都是免疫球蛋白，但并非所有的免疫球蛋白都是抗体。例如无免疫活性的免疫球蛋白（如骨髓瘤蛋白）就不是抗体，尽管其结构与抗体相似。抗体主要存在于血清内，但在其他体液及外分泌液中也有存在。抗原抗体分子之间存在着结构互补性和亲和性，使得抗原与相应抗体之间极易发生结合反应，这种反应具有高特异性（即专一性）和可逆性。,第一节 酶联免疫分析概述,抗原、抗体发生如下免疫反应：Ag+Ab Ag-Ab该免疫反应遵
5、循可逆生物大分子相互作用的热动力学基本原理，其反应式为式中：Ab为游离的抗体结合位点的浓度；Ag为游离的抗原结合位点的浓度；Ab-Ag为抗原-抗体复合物的浓度；k1为正反应速率常数；k2为负反应速率常数；K为反应平衡常数（亲和常数）。,第一节 酶联免疫分析概述,这种抗原-抗体反应既可发生于体内（in vivo），也可发生于体外（in vitro）。抗体主要存在于血清中，在抗原、抗体的检测中多采用血清做试验，所以体外抗原-抗体反应也称为血清学反应（serologic reaction）。基于抗原-抗体反应的检测技术主要应用于以下几个方面：用已知抗原检测未知抗体；用已知抗体检测未知抗原；定性或定量
6、检测体内各种大分子物质；用已知抗体检测某些药物、激素等各种半抗原物质。,第一节 酶联免疫分析概述,二、酶标记免疫分析法及常用标记酶1、免疫分析法分类,第一节 酶联免疫分析概述,2、酶标记免疫分析法中使用的酶（1）酶联免疫分析中使用的酶应符合下列条件：纯度高、催化反应的转化速率高、专一性强；具有足够的偶联用标记基团，与抗原、抗体蛋白分子偶联后仍保持较高的催化活性；使用稳定性和保存稳定性好；测定酶活性的方法简便、灵敏、快速；待测体液中不存在与标记酶相同的酶；,第一节 酶联免疫分析概述,待测溶液中应该无底物、反应抑制剂和其他与酶发生反应的干扰物质；酶的来源、纯化和供应较方便，价格较低廉；均相酶免疫测
7、定法中使用的酶，还要求当抗体与半抗原-酶结合物结合后，酶活性表现出抑制或激活。,第一节 酶联免疫分析概述,（2）酶的评价指标 通常用RZ和酶的比活力评价标记酶的质量。RZ表示酶蛋白中活性部分与非活性部分最大吸光度的比值。酶的比活力指在特定条件下，每1mg酶或每1ml酶液所具有的酶活性单位数。（3）酶联免疫分析中的常用酶 下表列出了酶联免疫分析中的常用酶。其中EC编号是根据国际酶学委员会的规定采用四码编号法确定的每个酶的系统编号。,第一节 酶联免疫分析概述,酶联免疫分析常用酶,第一节 酶联免疫分析概述,辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）是一种提取自辣根中，相对
8、分子质量为44kDa的糖蛋白。其酶学活性部分包括脱辅基蛋白和血红素基团，辅基亚铁血红素在403nm波长呈现最大光吸收值。HRP的纯度以RZ值即A403nm/A275nm的值来衡量，高纯度HRP制剂的RZ3.0。通常以能在20、pH为6.0、20s的时间内催化底物邻苯三酚产生1mg红桔酚（purpurogallin）作为HRP酶的1个活性单位。用于标记的HRP比活性应大于250U/mg。,第一节 酶联免疫分析概述,碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP）几乎存在于动物和人体的所有组织中，尤其在肝脏、胎盘、白细胞、肾小管中含量高。AP是一种磷酸酯的水解酶，它能够催化磷酸单酯、磷
9、酸核苷及6-磷酸糖类等的水解，在释放磷酸盐的同时产生有色的或荧光的产物。碱性磷酸酶的分子质量为80100kDa，最适pH为8.010.0，随酶源和底物的不同而变化。AP活性的测定以对硝基磷酸苯酯（PNP）作为底物。用作标记的AP比活力应大于1000U/mg。,第一节 酶联免疫分析概述,葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD）即-D-葡萄糖氧化还原酶，一般由黑曲霉和青霉产生。它催化O2和-D-葡萄糖的反应形成H2O2和D-葡萄糖酸-内酯，酯再与水反应生成葡糖酸。其反应最适pH范围为4.07.0，pH5.5时，反应速率最大。葡萄糖氧化酶对-D-葡萄糖的-异头碳有高度专一性。葡萄糖氧化
10、酶的比活力至少为20U/mg。葡萄糖氧化酶在4下可稳定存在612个月。,第一节 酶联免疫分析概述,-D-半乳糖苷酶（-D-galactosidase，Gal）即乳糖酶（-lactase），广泛存在于植物、动物器官、细菌、酵母和真菌中。当Gal催化水解-D-半乳糖苷时，若得到的半乳糖残基转移到水分子受体，称为水解；若受体是糖或醇时，称为转半乳糖苷。Gal催化-D-半乳糖苷水解反应的最适pH为7.5，转化效率很高，且比HRP易于标记，背景值低，稳定性好。Gal比活力应不少于30U/mg，5能保存12年。,第一节 酶联免疫分析概述,第二节 酶联免疫吸附分析法,一、光度酶联免疫分析1、酶联免疫吸附分析
11、（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）原理使抗原或抗体结合到某种固相载体表面；抗原或抗体与某种酶联结成酶标抗原或抗体；在测定时，使受检标本和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相抗原或固相抗体起反应；用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例；加入酶反应底物，底物被酶催化为有色产物，产物量与标本中受检物的量相关，用分光光度法进行定量。,*Ag是酶标志抗原，Ag是未标志抗原，Ab是特异性抗体，(F)表示游离型的*Ag，(B)表示结合型的*Ag-Ab。,第二节 酶联免疫吸附分析法,2、EL
12、ISA的固相载体良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间性能相近。最常用的是聚苯乙烯。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。ELISA载体的形式有小试管、小珠和微量反应板。,第二节 酶联免疫吸附分析法,3、固相载体的包被与封闭（1）包被（coating）指将抗原或抗体连接到固相载体上的过程。以聚苯乙烯微量反应板为例，通常先将抗原或抗体溶于pH 9.6的碳酸盐缓冲液（或pH 7.2的磷酸盐缓冲液，pH 78的Tris-HCl缓冲液）中，加满反应孔，置4过夜，洗涤即可。包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化，每批材料需通过实验与酶结
13、合物的浓度协调选定。一般蛋白质的包被浓度为0.120g/ml。,第二节 酶联免疫吸附分析法,（2）封闭（blocking）指继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥ELISA后的步骤中干扰物质的再吸附。所有的ELISA固相载体均需封闭。常用封闭剂有0.05%0.5%BSA；10%小牛血清或1%明胶；脱脂奶粉，比较价廉，可高浓度使用（5%）。,第二节 酶联免疫吸附分析法,4、稀释液、洗涤液和酶反应终止液（1）稀释液用于稀释酶标抗体及标本。常用中性PBS或Tris-HCl缓冲液，其中含有无关高浓度蛋白（如10动物血清、1BSA（牛血清白蛋白
14、）、1明胶等）和非离子型表面活性剂（如0.05Tween 20或TritonX-100等）。（2）洗涤液一般与稀释液相同，常用PBS或Tris-HCl缓冲液。四种常用的抗体稀释液和三种常用的洗涤液列于表7-2。,第二节 酶联免疫吸附分析法,表7-2 常用的抗体稀释液和洗涤液,第二节 酶联免疫吸附分析法,（3）酶反应终止液 辣根过氧化物酶（HRP）反应终止液为2mol/L4mol/L H2SO4（HRP在酸性条件下丧失酶活性）。很多ELISA试剂采用碱性磷酸酶（AP）作为标记酶，用3mol/L NaOH终止酶反应后，黄色可稳定一段时间。,第二节 酶联免疫吸附分析法,5、ELISA法常用酶的底物系
15、统ELISA法对底物的要求：价廉易得、安全；显色性和稳定性好；底物本身最好为无色物质；终止酶催化反应后，底物不应再继续地自发性变性；其最终产物可溶、易于测定及光吸收值高。,第二节 酶联免疫吸附分析法,（1）辣根过氧化物酶的底物系统 常见底物有邻苯二胺（OPD，产物橙红色，测定波长492nm）、5-氨基水杨酸（5-AS，产物橙色，测定波长550nm）、3,3,5,5-四甲基联苯胺（TMB，产物红色，测定波长450nm）、2,2-连氮-二（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸盐）（ABTS）等。ABTS的反应曲线不好。OPD溶液具有光敏性，相对来说不稳定，且具有诱变特性。TMB的背景值低，溶液稳定，没有诱
16、变特性。,第二节 酶联免疫吸附分析法,（2）碱性磷酸酶的底物系统 常用的底物为对硝基磷酸苯酯（PNP），水解的产物为黄色的对硝基苯酚，可在405nm处检测其吸光度的变化，该底物的转化效率高，线性关系好。用酚酞磷酸酯为底物，水解生成的酚酞在碱性条件下呈红色，可在530nm处光度法测定。此外还可以百里酚酞单磷酸酯等为底物。,第二节 酶联免疫吸附分析法,（3）-D-半乳糖苷酶的底物系统 常见底物有邻硝基苯-D-半乳糖苷（ONPG），其水解的产物邻硝基苯酚在405nm处具有最大吸光度值。其他的底物有对硝基苯-D-半乳糖苷（PNPG）、苯基-D-半乳糖苷、氯酚红-D-半乳糖苷（CPRG）、9-羟基-3-
17、异吩噁唑酮-D-半乳糖苷（RG）等。（4）青霉素酶（PNC）的底物系统 常用底物有溴麝香草酚蓝（BTB）、青霉酮酸还原淀粉-碘复合物（SIC）、溴甲酚紫（BCP）和溴麝香草酚蓝（21）等。,第二节 酶联免疫吸附分析法,二、ELISA酶联方法和试验方法1、ELISA酶联方法ELISA酶联方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法。（1）戊二醛交联法 戊二醛是一种双功能团试剂，它可以联结具有氨基的酶和蛋白质。戊二醛交联法有一步法、两步法两种。,第二节 酶联免疫吸附分析法,图7-2 戊二醛一步法反应原理,一步法 将戊二醛直接加入酶与抗体的混合物中，反应后即得酶标记抗体。该法操作简便、有效，重复性
18、好。缺点是交联反应是随机的，酶与酶、抗体与抗体之间有可能交联。,第二节 酶联免疫吸附分析法,图7-3 戊二醛二步法反应原理,两步法 先将酶与戊二醛作用，透析除去多余的戊二醛后，再与抗体作用而形成酶标抗体；或先将抗体与戊二醛作用，再与酶联结。两步法的产物中绝大部分的酶与蛋白质是以1:1的比例结合的，有助于本底的改善。,第二节 酶联免疫吸附分析法,（2）过碘酸盐氧化法 本法只适用于含糖量较高的酶。辣根过氧化物酶（HRP）的标记常用此法。反应时，过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为活泼的醛基，可与蛋白质上的氨基形成Schiff氏碱而结合。图7-4 过碘酸盐氧化法,第二节 酶联免疫吸附分析法,2、EL
19、ISA试验方法ELISA法中有三个必要试剂：固相抗原或抗体；酶标记抗原或抗体；酶反应底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法。如双抗体夹心法、间接法、竞争法、异种动物抗体双夹心法、抗酶抗体法、竞争性抑制法、双夹心法和抗原直接包被法等方法。,第二节 酶联免疫吸附分析法,（1）双抗体夹心法双抗体夹心法（double antibody sandwich，DAS-ELISA）由Clark和Adams于1977年建立，是最经典的ELISA检测法。该法的灵敏度高，特异性强，但提纯免疫球蛋白和制备酶标记物要求技术性强，成本较高。该法只适用于二价或二价以上较大分子抗原
20、的检出和定量分析，而不能用于半抗原等小分子的测定。,第二节 酶联免疫吸附分析法,图7-5 双抗体夹心法,第二节 酶联免疫吸附分析法,（2）间接法间接法（indirect ELISA）是最常用的ELISA检测方法，其原理是利用酶标记的抗体和已与固相抗原结合的受检抗体相结合。该法只要更换不同的固相抗原，就可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。该方法不必为每个待测抗体（或抗原）制备特异性的酶标抗抗体（或酶标抗体），极大地简化了实验。,第二节 酶联免疫吸附分析法,图7-6 间接法,第二节 酶联免疫吸附分析法,（3）竞争法竞争法（competing ELISA）是利用待测抗原和酶标抗原与特异性抗
21、体竞争结合，或待测抗体和酶标抗体与特异性抗原竞争结合而进行测定的一种方法（图7-7）。,第二节 酶联免疫吸附分析法,图7-7 竞争法,第二节 酶联免疫吸附分析法,（4）异种动物抗体双夹心法异种动物抗体双夹心法（图7-8），又称间接双抗体夹心法（indirect DAS-ELISA）或三抗体夹心法（triple antibodies sandwich，TAS-ELISA）。此法可用通用的酶标记抗体检验多种病毒，它不仅免去了标记每种抗体，而且灵敏度有所提高。,第二节 酶联免疫吸附分析法,图7-8 异种动物抗体夹心法,第二节 酶联免疫吸附分析法,（5）抗酶抗体法抗酶抗体法（图7-9）是利用免疫学反应
22、而不是用化学交联反应来制备酶结合物，常用HRP为标记酶作为抗原免疫动物制备抗HRP抗体。可用一种动物（如兔）制备特异性抗体（第一抗体）和抗酶抗体（第三抗体），再用另一种动物（如羊）制备抗第一种动物（兔）IgG的抗体（第二抗体）。让这种抗IgG的第二抗体把第一抗体（兔IgG）和抗酶抗体（也为兔IgG）通过免疫学反应连接起来。最后让酶与抗酶抗体结合，通过对底物的作用而揭示在固相载体上待测抗原的存在。,第二节 酶联免疫吸附分析法,优点:HRP通过免疫学反应与抗体结合，避免了用化学方法交联时抗体活性的改变，也避免了HRP与其他蛋白质分子结合，防止标记抗体和游离的未标记抗体之间的竞争，提高了标记抗体的质
23、量。在纯化化学交联反应制备的酶结合物的过程中，除去未标记抗体比较困难，而且该法仅在制备抗酶抗体时用少量纯HRP作抗原，所以用较粗制的HRP与抗酶抗体形成免疫复合物，并不影响其质量，这大大节约了价格较昂贵的精制HRP。因为制备抗酶抗体必须在动物中进行，故抗酶抗体法多适用于检测动物中的抗体。,第二节 酶联免疫吸附分析法,图7-9 抗酶抗体法,第二节 酶联免疫吸附分析法,三、ELISA反应条件的选择1、酶标抗体浓度的选择先用200L IgG（100 mg/ml）包被小孔，再将酶标记抗体球蛋白系列稀释并加入小孔中，洗涤后，加底物反应，终止后测定吸光度。选择吸光度为1的稀释度作为酶标抗体最适浓度。,图7
24、-10 酶标抗体浓度的选择,第二节 酶联免疫吸附分析法,2、包被浓度的选择当包被抗原的浓度较低时，包被量随抗原浓度的增加而增大；当包被抗原达到一定浓度后，包被量为定值，不再随抗原浓度的增加而增大。此浓度称为抗原的饱和包被浓度。,图7-11 抗原包被量和ELISA反应的关系,第二节 酶联免疫吸附分析法,表7-3 SM-EDA-GA包被法中链霉素包被质量浓度对ELISA实验误差的影响,第二节 酶联免疫吸附分析法,3、酶-底物反应时间的选择抗原与抗体、抗体与酶标抗体反应一般在37反应23h达到高峰。时间太短，敏感性下降，时间太长，吸附的抗原或复合物（在这个温度下）可能脱落。酶-底物反应时间一般采用1
25、5min、30min或45min，也可以标准阳性血清为准，随时测定其OD值，当达到规定的OD值时，即终止反应。,第二节 酶联免疫吸附分析法,四、ELISA的定量计算与灵敏度1、ELISA的定量计算一般采用分光光度计测定结合物中的酶量和抗体蛋白（IgG）量，酶量和IgG计算方法如下。其中，0.4表示酶的A403nm值为1时，酶量为0.4mg/ml；0.42表示酶的A403nm值为1时，其相应A280nm值为0.42；0.62表示在A280nm值为1时，IgG量为0.62mg/ml；0.94表示酶、戊二醛结合后，A280nm增加约6。,第二节 酶联免疫吸附分析法,酶结合物中结合的酶量、酶结合率计算
26、方法：以采用过碘酸钠氧化法进行酶联为例，摩尔比值计算方法：酶量为1mg/ml，摩尔比值为1.52.0，酶结合率在30%以上时，可获得较好的ELISA分析结果。,第二节 酶联免疫吸附分析法,2、ELISA的灵敏度与ELISA放大系统（1）ELISA的灵敏度 ELISA的检出限已经达到10-810-12g，但对某些测定仍需更高的灵敏度。传统ELISA中显色剂发色团的吸光度是限制ELISA灵敏度的主要因素。改用荧光标记或其他化学发光物标记抗体替代酶标记抗体可以提高灵敏度。改变传统ELISA的操作程序也可以提高灵敏度，如SIMIT技术。采用放大系统是提高ELISA灵敏度的主要途径。,第二节 酶联免疫吸
27、附分析法,（2）ELISA放大系统 生物素-亲和素放大系统可增加抗体（或抗原）的标记率。生物素与亲和素结合速率较快且结合物的稳定性高（K=1015），不会在孵育和各种洗涤过程中脱落。生物素对抗体和酶的标记率高（10个生物素分子/抗体分子），且生物素分子易于活化，标记后不影响抗体和酶的活性。每个亲和素分子能结合4个生物素，因而可偶联更多的联结生物素的酶分子，从而提高ELISA的敏感性。生物素-亲和素标记体系有灵活多变的运用方式，可以适应不同的分析设计。,第二节 酶联免疫吸附分析法,微粒放大。用适当的微粒代替酶-抗体结合物也可以获得放大效果。每个微粒表面可以同时结合大量记酶和抗体分子。在包含微粒放
28、大的夹心ELISA法中，微粒通过结合于其上的第二抗体结合于抗原。微粒上又结合着标记酶，其数量远比第二抗体能结合的标记酶多，因此得以放大。例如，微颗粒放大系统用微颗粒硅胶（直径约40nm）作为中间体连接酶和抗体，避免酶和抗体直接连接。酶微颗粒硅胶可连接上千个酶分子，可使体系增敏，已用于测定甲胎蛋白，灵敏度放大两个数量级。,第二节 酶联免疫吸附分析法,五、ELISA法的应用酶免疫测定具有高度的特异性和敏感性，几乎所有的可溶性抗原-抗体系统均可用以检测，它的最小可测值达ng甚至pg水平。酶免疫测定在各应用领域中的普及，应归功于商品试剂盒和自动或半自动检测仪器的问世。目前应用较广的酶免疫检测项目一般有
29、试剂盒出售。完整的ELISA试剂盒应包含包被好的固相载体、酶结合物、底物和各种浓缩的稀释液、缓冲液等。这些试剂在冰箱中可保存半年以上，因此实验室中只需要用蒸馏水稀释全套试剂即可。,第二节 酶联免疫吸附分析法,六、微量致敏性杂质青霉噻唑蛋白的测定基因工程药品在生产过程中为防止污染，在细胞培养或发酵过程中常需加入一定量的青霉素。青霉素在水溶液中很容易和蛋白质结合形成过敏性杂质青霉噻唑（benzyl penicilloyl，BPO）蛋白，为确保基因工程药品的产品质量，可以用ELISA对基因工程药品中是否残存有青霉噻唑蛋白进行检测，其对样品中结合青霉素的绝对检出量小于0.310-6。,第二节 酶联免疫
30、吸附分析法,其实验步骤如下：（1）包被：用碳酸缓冲液（0.1mol/L，pH 9.6）直接包被待测抗原，200L/孔；包被BPO4-CY作为阳性对照，并设有包被抗原不加抗BPO血清和不包被抗原但加抗BPO血清两组阴性对照；此外，实验中还设有待测抗原-BSA抗血清相互作用组作为阴性血清对照；4冰箱过夜。（2）用洗涤液（BPS 0.01mol/L，pH 7.2）洗涤三次，每次3min。,第二节 酶联免疫吸附分析法,（3）与特异性抗体反应：在经洗涤好的酶标板中加入稀释至一定滴度的抗BPO血清或抗BPO单克隆抗体，200L/孔，37保温2h。（4）洗涤三次。（5）与酶联抗抗体反应：再加入150稀释的G
31、AR-IgG-HRP 200L/孔，37保温1h。（6）洗涤三次。（7）显色：加入OPD底物液，200L/孔，37显色。,第二节 酶联免疫吸附分析法,（8）用1mol/L的硫酸终止反应，50L/孔，用酶标仪测定其在492nm波长处的光吸收值。（9）结果判断：当阳性孔呈阳性，阴性血清呈阴性时实验成立。若当待测抗原的测定结果大于阴性对照均值（X）与其2倍标准差（SD）之和（X+2SD），判为阳性；若小于X+SD，判为阴性；若在X+2SD与X+SD之间需要调整试验条件重新测试。ELISA测定125SerIL-2中青霉噻唑蛋白的结果如下（见表7-4）：,第二节 酶联免疫吸附分析法,表7-4 ELISA
32、实验测定125SerIL-2*中青霉噻唑蛋白,第二节 酶联免疫吸附分析法,包被样品稀释至约210-6mg（110-16mol）/孔时，ELISA反应仍为阳性，提示样品中BPO的量大于110-5mol，即待测样品中含有结合青霉素的绝对含量为千分之一左右。,第二节 酶联免疫吸附分析法,一、化学发光分析1、化学发光（chemiluminescence，CL）一些物质在进行化学反应时，吸收了化学反应过程中产生的化学能，使得分子外层电子激发到激发态，生成激发态产物。当电子从激发态的最低振动能级回到基态的各个振动能级时，以光辐射的形式释放能量，这个发光过程称为化学发光，其反应过程如下：发光效率表示一个化学
33、发光分子的量子产率，指每摩尔反应物辐射出光子的量。,第三节 发光酶联免疫分析,2、化学发光分析化学发光分析是根据化学反应产生的光辐射确定物质含量的一种痕量分析方法。化学发光免疫分析（CLIA）是将化学发光反应与免疫反应相结合而对抗体、抗原或半抗原进行测定的一种免疫分析方法。,第三节 发光酶联免疫分析,3、化学发光剂用作标记的化学发光剂应符合以下条件：能参与化学发光反应；与抗原或抗体偶联后能形成稳定结合物；偶联后仍保留高的量子产率和反应动力；不改变或极少改变被标记物的物理化学特性，特别是免疫活性。常用的化学发光剂有吖啶酯类化合物、氨基苯二酰肼类化合物、咪唑类化合物、苯酚类化合物、芳基草酸酯类化合
34、物等。,第三节 发光酶联免疫分析,（1）吖啶酯类化合物 吖啶酯是三环有机化合物，很容易氧化。当其在碱性介质中氧化时，经历共价键的断裂，产生二氧酮的中间体，然后形成电激发的N-甲基吖啶酮。当它回复到基态时在430nm处释放出光子。在加入H2O2及随后加入NaOH调节至所需pH之前维持一低pH以实现最佳氧化过程，可加速其氧化反应。吖啶酯氧化反应如图7-12所示。,第三节 发光酶联免疫分析,图7-12 吖啶酯氧化反应过程,第三节 发光酶联免疫分析,吖啶酯类化学发光剂的典型代表是光泽精（N,N-二甲基吖啶硝酸酯）。它在碱性条件下，与H2O2等过氧化物作用形成发光体激发态N-甲基吖啶酮。能促使光泽精激发
35、的物质还有丙酮、次黄嘌呤、黄嘌呤氧化酶、羟胺及抗坏血酸等。光泽精的氧化反应如图7-13所示。,第三节 发光酶联免疫分析,图7-13 光泽精的氧化反应,第三节 发光酶联免疫分析,吖啶酯类化合物作为化学发光标记物有显著的优点：氧化反应不需催化剂，只需要在碱性环境中就可以进行，发光反应快速，在1s内光子散射达到高峰，整个过程在2s内完成，可充分计数，背景噪声低。这类化合物与被标记物的结合发生在分子一定部位，在氧化反应过程中，结合物被分解，吖啶酯分子从发光的部分断裂并分离下来，所以吖啶酯的发光不受抑制，敏感度不受标记反应的影响，试剂稳定性好。,第三节 发光酶联免疫分析,（2）氨基苯二酰肼类化合物 鲁米
36、诺（5-氨基-2,3-二氢-1,4-酞嗪二酮）、异鲁米诺（6-氨基-2,3-二氢-1,4-酞嗪二酮）及其衍生物如氨丁基乙基异鲁米诺（ABEI）、氨己基乙基异鲁米诺（AHEI）、氨丁基乙基鲁米诺（ABENH）等均属于这一类化学发光剂。鲁米诺类化合物的发光反应必须有催化剂（如过氧化物酶）催化，且与蛋白或肽结合后其发光作用减弱，因此鲁米诺类化合物在CLIA中是很好的底物，但已较少用于CLIA的标记。,第三节 发光酶联免疫分析,图7-14 鲁米诺、异鲁米诺及其某些衍生物的结构式,第三节 发光酶联免疫分析,图7-15 鲁米诺化学发光反应过程,第三节 发光酶联免疫分析,（3）咪唑类化合物 咪唑类发光剂主要
37、是咯吩碱。其反应过程首先是咯吩碱在碱性二甲亚砜水溶液中形成过氧化物中间体，再进行重排，降解，伴随产生化学发光，如图7-16所示。,第三节 发光酶联免疫分析,图7-16 咯吩碱的化学发光反应,第三节 发光酶联免疫分析,（4）苯酚类化合物 用于化学发光免疫测定的酚类物质主要是邻苯三酚（焦性没食子酸），它是一种强还原剂，在催化剂（如HRP、血红素）催化下，与H2O2反应产生化学发光。（5）芳基草酸酯类化合物 这类化合物主要有双-（2,4,6-三氯苯基）草酸酯（TCPO）和双-（2,4-二硝基苯基）草酸酯（DNPO）。此类物质的发光反应是在反应体系中加入一种荧光染料如8-苯胺基-1-萘磺酸（ANS）作
38、为荧光载体，通过过氧化草酸酯中间产物捕获化学能，使荧光体处于激发态，退激至基态时，放出光子。,第三节 发光酶联免疫分析,二、化学发光酶联免疫分析1、化学发光酶联免疫分析以在酶催化反应中可以产生化学发光的发光物质作为底物，以化学发光法检测酶的活性，则为化学发光酶联免疫分析（chemiluminescent enzyme immuno-assay，CLEIA）。CLEIA方法的检测限低至10-17mol/L，达到或超过放射免疫分析的灵敏度。化学发光酶联免疫分析实际上是一种酶联免疫测定过程。,第三节 发光酶联免疫分析,2、CLEIA常用的标记酶CLEIA方法中最常用的是辣根过氧化物酶和葡萄糖氧化酶（
39、GOD）。此外还有丙酮酸激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、萤火虫素酶、碱性磷酸酶（AP）和-D-半乳糖苷酶等。HRP标记的CLEIA，常用的底物为鲁米诺或其衍生物。,第三节 发光酶联免疫分析,鲁米诺的氧化反应在碱性缓冲液中进行，通常以0.1mol/L、pH8.6的Tris缓冲液作底物液，鲁米诺和H2O2在无HRP催化时也能缓慢自发发光，而在最后光强度测定中造成空白干扰，因而宜分别配制成两瓶试剂溶液，只在用前即刻混合。HRP催化鲁米诺的氧化反应可被某些酚类物质（如对碘苯酚）或萤火虫荧光素酶等增强。增强剂的作用是增强发光和延长发光时间，由此可提高敏感度。另外一些金属配合物能催化鲁米诺的化学发光反应。,
40、第三节 发光酶联免疫分析,利用GOD对葡萄糖的催化氧化产生H2O2，用化学发光反应底物检测产生的H2O2，可间接测定GOD的活性。常见发光反应底物有鲁米诺、TCPO等。如Masako和Akio以GOD为标记酶，鲁米诺-H2O2作为发光底物，以流动注射化学发光分析测定17-羟基孕甾酮、甲胎蛋白和胰岛素，检测限分别为0.5pg/ml、0.1ng/ml和0.1ng/ml，而且分析速度快，测定结果精密度好。,第三节 发光酶联免疫分析,3、CLEIA常用的发光增强剂在反应体系中引入增强剂，可增强化学发光强度，提高化学发光测定的信噪比，提高化学发光酶联免疫分析灵敏度。最常用的增强剂有萤火虫荧光素、苯并噻唑
41、、苯酚取代物、取代联苯胺、酸类衍生物、萘酚等。例如，萤火虫素、6-羟基苯噻唑衍生物等能加强HRP催化鲁米诺等的化学发光反应，使其强度提高80倍；某些酸类衍生物尤其是对碘酸、苯甲酸等的增强效果更佳，可使其发光强度提高1000倍，且延长发光持续时间。,第三节 发光酶联免疫分析,三、生物发光酶联免疫分析在18851887年，Dubois从发光昆虫和有双壳的软体动物体内提炼出各种材料，发现这些材料混合在一起能产生发光；他将其中可被稳定加热的物质称为荧光素，而将加热不稳定的物质称为荧光素酶。生物发光现象的化学本质就是荧光素与荧光素酶发生化学反应，可看成是特殊形式的化学发光。一般而言，生物发光量子产率和特
42、异性均比化学发光高，量子产率接近100，发光强度大，持续时间长，发光稳定，故生物发光分析灵敏度高，容易测定。,第三节 发光酶联免疫分析,将高灵敏度的生物发光与特异性的酶联免疫分析技术相结合便形成生物发光酶联免疫分析法（BLEIA）。常采用戊二醛法将荧光素酶与抗原或抗体结合。现在已经可以提取纯度很高的荧光素和荧光素酶，建立起了各种各样的生物发光酶联免疫分析方法，这些方法应用于生物体液中各种激素、药物、微生物、抗原、抗体等成分的测定。生物发光酶联免疫分析在临床分析上也越来越广泛地引起人们的重视。,第三节 发光酶联免疫分析,最常用于生物发光酶联免疫分析的生物发光反应有以下两种：（1）荧光素-荧光素酶
43、生物发光体系。荧光素（LH2）和荧光素酶（E）在三磷酸腺苷（ATP）、Mg2+、O2存在下，可产生焦磷酸（PPi）和一磷酸腺苷（AMP），接着O2和E，LH2，AMP引导荧光素脱羧，形成激发态产物氧化荧光素（L*），它在返回基态时发光，发射光的波长max=562nm。利用上述生物发光反应与一个酶催化的反应相耦合，即可进行生物发光酶联免疫分析。,第三节 发光酶联免疫分析,例如用葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记三硝基甲苯（TNT），利用葡萄糖-6-磷酸脱氢酶能催化葡萄糖-6-磷酸和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的反应与生物发光反应相耦合。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的活性较好，1.010-18mol/L的葡
44、萄糖-6-磷酸脱氢酶每分钟能产生4.010-14mol/L的NADH，这样可以大大提高灵敏度，对TNT的检测限达1.010-18mol/L。,第三节 发光酶联免疫分析,（2）荧光素酶-黄素单核苷酸（FMN）细菌生物发光体系。此体系中有荧光素酶和FMN氧化还原酶两种酶参与。FMN氧化还原酶在还原型辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（辅酶-NADPH）和H+存在下，能使FMN还原成还原型的黄素单核苷酸（FMNH2）。接着荧光素酶在有O2的情况下，催化还原型黄素单核苷酸和长链脂肪醛氧化产生FMN和长链脂肪酸并产生发光，发射波长为max=490nm，从而可以进行生物发光酶联免疫检测。,第三节 发光酶联免疫分析,
45、四、发光酶联免疫分析的应用发光酶联免疫分析是现代痕量分析中一项重要技术，其应用非常广泛，已有大量综述文献，这里不做详细介绍，仅以标记HRP、GOD的化学发光酶联免疫分析和生物发光酶联免疫分析为例做简单说明。（1）以HRP为标记酶标记抗原或抗体，以鲁米诺-H2O2为底物测定了单纯疱疹病毒、人绒毛膜促性腺激素、白色念珠菌等物质；以异鲁米诺-H2O2为底物测定了巨细胞病毒抗原、甲胎蛋白、抗鲁白宁IgG、皮质醇等；以邻苯三酚-H2O2为底物测定登革热型病毒b、伤寒杆菌、细菌内毒素等物质。,第三节 发光酶联免疫分析,（2）以GOD为标记酶标记抗原或抗体，以鲁米诺-H2O2为底物测定了17-羟基孕甾酮、甲
46、胎蛋白、胰岛素、甲状腺素等；以双-（2,4,6-三氯苯基）草酸酯（TCPO）-H2O2为底物测定了脱氢表雄甾酮、甲胎蛋白、促甲状腺素、催乳素、17-羟基孕甾酮等物质。,第三节 发光酶联免疫分析,（3）以荧光素酶为标记酶，以荧光素酶-荧光素发光体系的生物发光酶联免疫分析测定了转铁蛋白、胰岛素、艮他霉素、氨甲蝶呤、马来酰亚胺苯甲酰基-N-琥珀酰亚胺、孕酮、人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白、促黄体生成激素等；以荧光素酶-FMN生物发光体系的生物发光酶联免疫分析测定了二硝基苯酚、三硝基甲苯、甲胎蛋白等各种物质。它们的检测限可达到pmol/L甚至fmol/L级。,第三节 发光酶联免疫分析,1、什么是免疫分析
47、？2、免疫分析方法可分为哪些种类？3、酶标记免疫分析法中使用的酶应符合哪些条件？如何对所用酶的质量进行评价？酶联免疫分析中常用的酶有哪些？4、简述ELISA的原理及特点。5、ELISA固相载体的一般采用什么材料，有哪些形式？6、什么是包被？什么是封闭？7、ELISA中常使用哪些稀释液、洗涤液和酶反应终止液？8、辣根过氧化物酶的RZ值是指什么？对其有什么要求？HRP的常用底物有哪些？AP的常用底物有哪些？-D-半乳糖苷酶的常用底物有哪些？青霉素酶的常用底物有哪些？,思考题,9、ELISA的酶联有哪些方法？10、ELISA试验方法有哪些，如何进行？11、ELISA反应中，如何选择适宜的包被浓度？如何选择适宜的酶结合物浓度？如何选择适宜的酶-底物反应时间？12、ELISA放大系统有哪些？13、如何计算酶标记免疫复合物中的酶量、酶结合率和摩尔比值？14、化学发光是如何产生的？化学发光剂有哪些种类？15、化学发光免疫分析可分为哪些种类？16、化学发光酶联免疫分析常用的标记酶有哪些？化学发光酶联免疫分析常用的发光增强剂有哪些？17、最常用于生物发光酶联免疫分析的生物发光反应有哪些？,思考题,
