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1、1,长非编码RNALong noncoding RNAs,2,长非编码RNA是什么？长非编码RNA是怎么发现的？长非编码RNA有多少？,长非编码RNA的系统发现,RNA长度大于200ntRNA不编码蛋白质,长非编码RNA定义,长非编码RNA发现历程,1989年 H19,1990年 Xist,2007年 HOTAIR,5,长非编码RNA是转录组的重要组成部分,6,长非编码RNA的系统发现,Rinn et al.2003,Genes Dev,Rinn et al.2007,Cell231 HOX ncRNAs,Tiling Array,7,长非编码RNA的系统发现,ChIP-Seq,Guttman
2、 et al.2009,nature,1600 lncNRA,Khalil et al.2009,PNAS,3300 lncRNAs,8,RNA-Seq,Guttman et al.2 May 2010,Nature Biotechnology,1140 new lncRNAs,Scripture,长非编码RNA的系统发现,9,RNA-Seq,Trapnell et al.2 May 2010,Nature Biotechnology,3724 new lncRNAs,Cufflinks,长非编码RNA的系统发现,10,Cole Trapnell:TopHat(2009),Cufflinks(
3、2010)PhD Steven Salzberg,University of Maryland Lior Pachter,University of California,BerkeleyPostdoc Join Rinns lab,The Broad Institute,长非编码RNA的系统发现,11,长非编码RNA的系统发现,12,RNA-Seq,Cabili et al.2011,Gene Dev,8195 lncRNAs,长非编码RNA的系统发现,13,RNA-Seq,Derrien et al.2012,Genome Research9277 lncNRA genes,14880 l
4、ncRNA transcripts,长非编码RNA的系统发现,14,Rinn and Chang,2012,整合多种数据系统发现长非编码RNA的流程,长非编码RNA的系统发现,15,还有什么办法可以发现更多的lncRNA？,Iyer et al.2015,Nature Genetics7,256 RNA-seq,58,648 lncRNAs,of which 79%were previously unannotated,长非编码RNA的系统发现,长非编码RNA是长度大于200nt，但是不编码蛋白质的一类RNA。长非编码RNA的发现得益于高通量技术的进步。长非编码RNA至少有58000条（Iye
5、r et al.2015,Nature Genetics）,17,我们对长非编码RNA的了解有多少？长非编码RNA有什么功能？,长非编码RNA的特征和作用机制,RNA的研究历程,Advances in Genomics and Genetics 2015:5,长非编码RNA具有更强的物种特异性,长非编码RNA每年发表文章数,长非编码RNA的特征 与蛋白质编码基因类似的基因结构 部分具有 PolyA尾一般具有复杂的高级结构,长非编码基因及转录本示例,22,Rinn and Chang,2012,Sense,Ruscio et al.2013,长非编码RNA的分类,长非编码RNA的功能,参与几乎所
6、有的生物学过程细胞干性维持发育分化表观遗传调控 与疾病的发生发展有重要关系 肿瘤神经退行性疾病免疫系统疾病,长非编码RNA作用机制,Fatima et al.Molecular and Cellular Therapies(2015)3:5,LncRNA-miRNA,LncRNA-mRNA,表观水平,转录水平,转录后,蛋白功能,Rinn and Chang,2012,Ulitsky and Bartel,2013,长非编码RNA作用机制,目标长非编码RNA的选择,芯片,测序,经济实惠,快速筛选,信息量更大,发现新转录本,高通量筛选方法,27,长非编码RNA数据是怎么收集整理的？长非编码RNA表
7、达谱芯片探针是怎么设计的？长非编码RNA表达谱数据怎么分析？,长非编码RNA表达谱芯片设计及数据分析,28,长非编码RNA表达谱芯片设计,长非编码RNA表达谱芯片版本更新,37,491 lncRNA 34,235 mRNA,35,024 lncRNA 32,205 mRNA,2011.05,2012.03,2013.08,30,756 lncRNA,40,916 lncRNA 34,235 mRNA,2014.06,109,813 lncRNA36,000 mRNA,2015.12,HSA-LNCPC-EXP-05,HSA-LNC-EXP-01,HSA-LNCPC-EXP-04,HSA-LNC
8、PC-EXP-03,HSA-LNC-EXP-02,29,长非编码RNA表达谱芯片设计,人类蛋白质编码基因,为109,813 lncRNA设计特异性探针,为36,000 mRNA设计特异性探针,lncRNA表达谱芯片V5,HSA-LNCPC-EXP-05,30,长非编码RNA芯片数据来源,长非编码RNA表达谱芯片设计,31,长非编码RNA在不同的数据集有冗余,长非编码RNA表达谱芯片设计,32,长非编码RNA探针设计流程,长非编码RNA参考数据集,RefSeq,UCSC,H-InvDB,交叉注释&序列比对&基因组定位分析,长非编码RNA完备集合,每一条长非编码RNA都设计一条特异的探针,长非编码
9、RNA表达谱芯片设计,33,探针设计原则探针序列的唯一性统一探针长度控制GC含量控制TM值避免单一碱基的连续重复避免探针内部产生发卡结构,长非编码RNA表达谱芯片设计,34,荧光信号,表达谱,芯片质量评估,标准化,差异表达分析,Quantile,Detected Not detectedCompromised,数据分析流程,长非编码RNA表达谱数据分析,35,适用范围双通道芯片Cy3 绿色Cy5 红色目的消除由于荧光染料染色效率的差异等因素导致的系统误差对寻找差异表达基因的影响,芯片内标准化,长非编码RNA表达谱数据分析,36,芯片内标准化,MA Plot,LOWESS(locally wei
10、ghted scatterplot smoothing，局部加权回归散点平滑法),M,A,标准化,长非编码RNA表达谱数据分析,37,芯片间标准化,适用范围单通道双通道目的消除人为因素、芯片系统误差、实验平台偏差等,长非编码RNA表达谱数据分析,38,芯片间标准化,中位数标准化,Quantile标准化 c,标准化,长非编码RNA表达谱数据分析,39,假设检验常用方法Fold Change:没有重复实验Wilcoxons rank-sum test:总体分布未知T-test:总体服从正态分布Paired T-test:样本成对出现 总体服从正态分布SAM,差异表达基因分析,长非编码RNA表达谱数
11、据分析,40,差异表达基因分析,SAM(Significance Analysis of Microarrays)2001,Stanford University,Permutation test,长非编码RNA表达谱数据分析,41,多重假设检验假阳性率校正,多重假设检验(Multiple Hypothesis Testing)假阳性如果一个test的5%的level下执行，I类错误率只有5%，那么只有5%的机会可能在零假设为真时拒绝零假设。那么在100次test中，我们错误拒绝零假设的期望值是5.如果每个test都是独立的，那么至少有一个不正确拒绝的概率是99.4%()FDR(False D
12、iscovery Rate),长非编码RNA表达谱数据分析,42,多重假设检验假阳性率校正,FDR校正方法BenjaminiHochberg procedure(BH)对于 个独立的假设检验，为每个假设检验的p-value将 升序排列记为,所对应的原假设记为；对给定的，找最大的 满足，即3.若不存在，则不拒绝任何原假设，否则拒绝所有的,长非编码RNA表达谱数据分析,43,长非编码RNA来自十几个国际权威数据库，以及文献资料。利用三种方法去除冗余序列，得到完备的长非编码RNA数据。长非编码RNA表达谱芯片选用Affymetrix平台，按照严格的准则设计探针。长非编码RNA表达谱数据分析通常包括前
13、处理、归一化、差异表达分析，假阳性率校正等,44,长非编码RNA表达谱芯片能否检测到每个外显子的表达水平？,长非编码RNA外显子芯片设计,长非编码基因外显子芯片设计流程,长非编码基因外显子芯片探针数目统计,70,762 长非编码基因109,813 长非编码RNA每个基因设计探针的平均数为40在外显子区总共设计4,369,873条探针每个外显子平均设计10条探针在外显子连接处总共设计690,198条探针每个外显子连接处设计4条探针,47,长非编码RNA外显子芯片可以检测到每个外显子的表达水平，进而可以得到每个可变剪切体的表达水平,长非编码RNA研究案例,案例1：通过芯片筛选p53基因调控的长非编
14、码RNA-LncRNA-p21,芯片筛选LncRNA-p21,LncRNA-p21是受p53调控的lncRNA,LncRNA-p21抑制一系列基因表达，与p53谱系相似,LncRNA-p21促进凋亡,LncRNA-p21与hnRNP-K蛋白直接结合,LncRNA-p21受p53调控，并与hnRNP-K蛋白直接结合，抑制细胞凋亡,案例2：系统发现肿瘤相关的长非编码RNA,80对肿瘤标本表达谱差异性分析,差异表达长非编码RNA实验验证,长非编码RNA与编码基因以及miRNA相关性分析,相关文章,Functional Characterization of Long Non-coding RNA L
15、nc_bc060912 in Human Lung Carcinoma Cells.Biochemistry.2015 May 12;54(18):2895-902.LncRNA MT1JP functions as a tumor suppressor by interactingwith TIAR to modulate the p53 pathway.Oncotarget.2016 Feb 19,案例3：基于lncRNA表达谱芯片发现食管鳞癌预后相关分子标记,预后研究,关键词：食管鳞癌（ESCC）生存预后转录组水平的分子标记长链非编码RNA（lncRNA）,食管鳞癌及预后相关分子标记背景
16、,预后研究,食管鳞癌及预后相关分子标记研究特色,关键词：119+60例ESCC癌癌旁配对样本完整的生存数据等临床信息双通道mRNA+lncRNA联合芯片经典机器学习方法,6389 lncRNA,119例食管鳞癌病人,双向层次聚类热图,lncRNA在癌与癌旁中存在显著表达差异,训练集（n=60）,验证集（n=60）,测试集（n=59）,找到一组包含3个lncRNA的预后标记,次要lncRNA剔除,“随机森林”构建决策树,lncRNA重要性打分,主要方法：“随机森林”降维,全部组合遍历,构建最近邻类中心分类器,分类判别并计算识别准确率,主要方法：分类器构建与遍历,最终选择：兼顾高准确率与低复杂度,
17、主要方法：最佳组合选取,68,研究长非编码RNA的功能，有哪些网络资源可以利用？,长非编码RNA功能研究公共数据资源,69,与长非编码RNA相关联的蛋白质编码基因功能富集分析,长非编码RNA功能研究公共数据资源,70,与长非编码RNA相互作用生物大分子检索,长非编码RNA功能研究公共数据资源,71,与长非编码RNA相互作用生物大分子检索,长非编码RNA功能研究公共数据资源,72,长非编码RNA功能研究公共数据资源,长非编码基因启动子区转录因子结合位点的预测,http,73,长非编码RNA功能挖掘的公共数据资源,可视化工具,74,可以借助网络资源，发现长非编码RNA相关联的蛋白质编码基因的功能，发现长非编码RNA相互作用的生物大分子，发现能够调控长非编码基因转录的因子等,谢谢大家！,
