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1、食品分析Food analysis,层析技术,层析技术,层析法也称色谱法，是1906年俄国植物学家发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为“色谱法”。,引言,后来无色物质也可利用吸附柱层析分离。1944年出现纸层析。以后层析法不断发展，相继出现气相层析、高压液相层析、薄层层析、亲和层析、凝胶层析等。,层析法的基本原理,层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分布程度不同，从而使各组分以不
2、同的速度移动而达到分离的目的。,层析法的分类,按两相所处的状态分类：流动相有两种状态：*液体作为流动相*气体作为流动相 固定相也有两种状态：*固体吸附剂作为固定相*以吸附在固体上的液体作为固定相按两相所处的状态分为：液相层析 液-固层析 液-液层析 气相层析 气-固层析 气-液层析,按层析过程的机理分类 吸附层析：利用吸附剂对不同组分吸附性能的差异，从而达到分离鉴定的目的。分配层析：利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数不同，使之分离。离子交换层析：利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同，使之分离。凝胶层析：利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同，使之分离。,按操作形式不同分类 柱
3、层析：将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动从而达到分离。纸层析：用滤纸做液体的载体，点样后，用流动相展开，以达到分离鉴定的目的。薄层层析：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以纸层析类似的方法进行物质的分离和鉴定。,柱层析,把吸附剂装在一支玻璃管中,做成色谱柱。然 后将试液加在柱内，若试液中含有A、B两种组分，则A和B便被吸附剂（固定相）吸附在柱的上端。再用一种洗脱剂（流动相）进行冲脱，这时在管内就连续不断发生溶解、吸附、再溶解、再吸附的现象。如果对A的吸附能力较弱，则A就较易溶解而较难吸附，在柱中移动就较快。当冲洗到一定程度时，两者即可以完全分开，形成两个带。在继续冲洗，A物质便从柱中流出来，将流
4、出液承接于一个容器中。然后B物质被洗脱下来，用另一个容器承接。这样便可将A、B两种物质分离。如下图所示,纸层析,这是一种微量分离方法。用滤纸做载体，利用纸上吸着的水分作为固定相，将滤纸条点试液的一端浸在有机溶剂中（注意不要把原点浸入有机溶剂中）该有机溶剂为流动相（展开剂）。由于滤纸条毛细管的作用。流动相将不断上升，当流动相上升的时候，与点在滤纸条上的试样相遇，这时试样中欲分离的组分就溶解在流动相中并随之上升。当欲分离的组分遇到上面的固定相时，又溶解在固定相中而停下来，接着又被不断上升的流动相所溶解。于是就在两相之间一次又一次地发生分配过程（相当于一次又一次的萃取），从而将各组分逐个分开。,薄层
5、层析,利用吸附剂对化合物吸附能力的不同而达到分离，吸附剂吸附能力的大小与化合物极性大小有关。由于硅胶或氧化铝薄层的毛细管作用，展开剂将沿着薄层逐渐上升。在上升过程中，当遇到新的吸附剂时，又被吸附下来。接着又被不断流过的展开剂溶解，再随着展开剂继续上升。试样中的各个组分将按照它们对硅胶或氧化铝吸附能力强弱的不同而分离开来。化合物极性大，被吸附剂吸附得牢，Rf值小，反之，化合物极性小，Rf值大。,特点：薄层层析法分离迅速，一般1560min内可以完成，操作简便，灵敏度高。近年广泛应该在制药、农药、染料、抗生素等工业中。,薄层层析操作方法,1、硅胶CMCNa薄层板的制备：称取CMCNa(羧甲基纤维素
6、钠)0.15g溶于30mL蒸馏水中搅拌(如不溶可加热)至全部溶解加入层析用硅胶10g充分搅拌均匀，研磨成糊状倒入玻璃板，用食指和拇指拿住玻片，作前后左右轻轻摇动，至流动的硅胶均匀地铺在玻璃片上,水平放置，室温阴干至无水气存在于105烘箱中活化2h干燥器中冷却备用2、点样选取制备好的薄板一块，在距底边2cm 的水平直线上选几个点，各点间距1.5或2cm，离板边约有lcm的距离。用毛细管分别点上不同的样品于各个点，样品量控制在510g，斑点直径一般为23 mm，干后再点一次。,3、展层点样完毕，待薄层上样品自然干燥后，将薄板置于盛有层析溶剂的层折缸中，薄板与液面成15左右的夹角，点有样品的一端浸入
7、溶剂中，深达0.5cm左右、扩展剂液面应低于点样线，盖好层析槽盖，自下向上展层，当展层溶剂到达离薄板顶端约1cm 处时取出薄板，标出溶剂前沿位置，用热风吹干。4、显色：除尽溶剂后用喷雾器均匀地喷上显色剂，烘干使其显色，计算Rf值。或使之出现各种有色的斑点，与标准进行对照比较，可确定其成分。Rf=起始线到样品斑点中心距离/起始线到溶剂前沿的距离,1、吸附层析技术,吸附层析法（液-固色谱法，LSC）原理 利用固定相的固体吸附剂表面对不同组分吸附力的大小及洗脱液对它的溶解作用（解吸作用）的差异进行分离。特点 适合分离不同种类的化合物(醇类和芳香烃）,二、吸附剂吸附剂是具有大表面积的活性多孔固体，活性
8、多孔固体与待分离物质的极性官能团作用。常用的吸附剂有活性炭、硅石、氧化铝、羟基磷灰石等。羟基磷灰石（HA）Ca10(PO4)6.(OH)2,可用于分离蛋白质与核酸。其表面有Ca2+和PO43-两种带电基团；酸性和中性蛋白质可与Ca2+结合；碱性蛋白质可与PO43-结合。HA柱层析最重要的用途之一是分离单链DNA和双链DNA，因为它对双链DNA的亲和力大于单链DNA。,2、分配层析技术,分配层析法（液-液层析法，LLC）原理 利用混合物在两种不相混溶的液相（固定相和流动相）之间的分配系数的不同而达到分离各组分的目的。固定相液体均匀覆盖于载体表面，流动相流过固定相。分配系数：当一种溶质分布在两个互
9、不相溶的溶剂中时，它在两种溶剂中的浓度之比是个常数，称为分配系数。K=c1/c2 分配系数小的溶质在流动相中的分配的数量多，移动快；分配系数大的溶质在固定相分配的数量多，移动慢。因此可彼此分开特点：液-液层析法适合于分离同系物或同分异构体,A,A,B,C,D,E,32,16,16,8,16,8,4,4,12,12,2,2,8,12,8,层析柱分离物质的示意图,固定相为固体颗粒，装在层析柱内，高5cm，固定相周围充满液体流动相，每厘米柱中液相体积为1cm3。若在柱顶加入1cm3溶剂,其中含32mg样品，同时应有相同体积的溶剂从柱底流出，此时样品处于柱中A位置。若样品的分配系数是1，则它在固相与液
10、相间等量分配。若再有1cm3的溶剂加到柱上，A部分中的溶剂带着16mg的物质向下移动到B，A和B中的物质都将发生再分配.,3、凝胶过滤层析技术,基本原理概念（排阻层析，分子筛层析）：当生物大分子通过装有凝胶颗粒的层析柱时，根据它们分子大小不同而进行分离的技术。原理 凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离的混合物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外，在柱内经过的路程较长移动速度较慢，最后被洗脱出来。,凝胶颗粒,凝胶过滤在试验室中的应用,1）生物大分子物质的分离纯化2）分子量的测定3）分级分离4
11、）溶液浓缩5）平衡常数的测定6）细胞及颗粒的分离,LogM=k1-k2Ve,蛋白质通过凝胶柱的速度即洗脱体积与其分子量有关，,（Ve为洗脱体积）,先测得几种标准蛋白质的Ve，并以其分子量对数对Ve作图得一直线，再测出待测样品的Ve，查标准曲线即可确定分子量。,原理 根据离子交换树脂对需要分离的各种离子的亲和力不同而达到分离的目的。将离子交换树脂装入层析柱。离子交换树脂通常是不溶于水的高分子物质，分子中含有可解离的基团.含有酸性可解离基团的称为阳离子交换树脂，可解离出 H+，含有碱性可解离基团的称 为阴离子交换树脂，可解离出 OH-,4、离子交换层析法,离子交换层析的基本原理,+,+,+,+,+
12、,若选择阳离子交换树脂，则带正电荷的物质与H+发生交换而结合在树脂上。若选择阴离子交换树脂，则带负电荷的物质可与OH-发生交换而结合在树脂上。物质在树脂上结合的牢固程度即亲和力大小有差异，因此选用适当的洗脱液便可将混合物中的组分逐个洗脱下来，达到分离纯化的目的。,+,+,原理 利用生物大分子间特异的亲和能力来纯化生物大分子 如：抗原和抗体；酶和底物或辅酶或抑制剂；激素和受体；RNA和其互补的DNA等。将待纯化物质的特异配体通过适当的化学反应共价的连接到载体上，待纯化的物质可被配体吸附，杂质则不被吸附，通过洗脱杂质即可除去。被结合的物质再用含游离的相应配体溶液把它从柱上洗脱下来。,5、亲和层析法
13、,+,C,C,C,配基,蛋白质,1.配基固相化,2.亲和吸附,固体载体,3.解吸附,6、免疫亲和层析柱（IAC）,近年来免疫亲和层析柱（IAC）开始被用于有选择性地从复杂基体样本中提取（净化）小分子待测物，如药物、激素、农药和真菌毒素等。IAC技术简化了小分子待测物样品净化程序，避免了大量有毒、有异味的有机溶剂的使用。,吸附原理,待测物被柱子中免疫吸附剂上的抗体所吸附，通过淋洗除去柱上吸附的杂质，最后待测样品被一种易蒸发的溶剂洗脱下来。用IAC技术，样品通常只经过一次萃取就可直接用于薄层色谱法、荧光光度法、HPLC或GC-MS测定，也可用免疫学方法检测。,工作原理,7、高压液相层析（HPLC）,特点 使用的固相支持剂颗粒很细，表面积很大,因而分辨率很高。溶剂系统采用高压，因此洗脱速度增大。许多类型的柱层析都可用HPLC来代替，如分配层析、离子交换层析、吸附层析、凝胶过滤等。,
