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1、食品微生物学检验,主要内容,食品微生物检测基础食品微生物检测指标食品微生物检测程序,第一部分 食品微生物检测基础,1 微生物（microorganism,microbe）非分类学上名词，来自法语“Microbe”一词。是形体微小、单细胞或个体结构简单的多细胞、甚或无细胞结构的低等生物的通称。通常人肉眼看不见，必须借助于光学显微镜、电子显微镜放大几百倍、几千倍甚至几万倍才能看到的生物。,一、什么是微生物,E.coli,体积小、大小以um计，但比表面积（表面积/体积）大，必然有一个巨大的营养吸收，代谢废物排泄和环境信息接受面。这一特点也是微生物与一切大型生物相区别的关键所在。,小,微小生物包括：有
2、细胞结构：原核结构的细菌（Bacteria）、古生菌（Archeae）真核细胞结构的真菌（酵母、霉菌、蕈菌）、单细胞藻类、原生动物。无细胞结构：不能独立生存的病毒、亚病毒（类病毒、拟病毒、朊病毒）,2 微生物的生境 生境：生物生命的环境区间；依据生境的理化指标分为温和环境和极端环境。,红色代表古细菌；蓝色代表细菌；浅绿色代表藻类；棕色代表真菌；黄色代表原生动物；绿色代表植物；紫色代表动物,红色代表古细菌；蓝色代表细菌；浅绿色代表藻类；棕色代表真菌；黄色代表原生动物；绿色代表植物；紫色代表动物,温和的环境 无处不存在微生物的生存环境。意味着微生物无处不在，我们无时不生活在“微生物的海洋”中。,细
3、菌数亿/g土壤，土壤中的细菌总重量估计为：10034 10 12 吨；,每张纸币带细菌：900万个；,人体体表及体内存在大量的微生物：皮肤表面：平均10万个细菌/平方厘米；肠道：微生物总量达100万亿，粪便干重的1/3是细菌，每克粪便的细菌总数为：1000亿个；,口腔：细菌种类超过500种；每个喷嚏的飞沫含4500-150000个细菌，重感冒患者为8500万；,常见的极端环境,Fig.1 微生物生长的极端环境A 盐碱干旱地 B 海底火山口 C 南极冰川 D 海滩晒盐场 E 星球高辐射表面,A,B,C,D,E,极端环境：普通生物无法生存的环境。,大公古盐井（自贡，凿于北周时期）,二、微生物与食品
4、工业,一般来说，微生物既可以在食品制造中起有益作用，又可以通过食品给人类带来危害。,远古人类发现，吃剩的米粥数日后变成了醇香可口的饮料酒,微生物引起的食物中毒,霍乱病人,微生物在食品中的应用有三种方式微生物菌体的应用：食用菌就是受人们欢迎的食品，乳酸菌可引起蔬菜和乳类及其它多种食品的发酵，所以，人们在食用酸牛奶和酸泡菜时也食用了大量的乳酸菌；单细胞蛋白就是微生物体中获得的蛋白质，也是人们对微生物菌体的利用。微生物代谢产物的应用：如酒类、食醋、氨基酸、有机酸、维生素等。微生物酶的应用：,总之，食品微生物学的任务在于研究有益微生物在食品中的应用，为人类提供有益与健康、营养丰富的食品，并避免在食品制
5、造、流通和保藏中有害微生物的污染，防止食品腐败和产毒，保证食品的安全性。,三、食品微生物学检测的意义,背 景,国内外食品安全形势严峻，恶性事件不断发生。欧洲“二噁英”、“疯牛病”（20世纪90年代）日本大肠杆菌O157:H7中毒（1996）中国SARS（2003）、东南亚国家禽流感（2004）美国菠菜大肠杆菌O157:H7污染事件（2006）,准确、可靠的检验结果是正确评价和保证食品安全性的先决条件，也是国际贸易上公平交易的有力科学依据。,食品微生物检验方法：为食品监测必不可少的重要组成部分。它是衡量食品卫生质量的重要指标之一,也是判定被检食品能否食用的科学依据之一。可以判断食品加工环境及食品
6、卫生环境,能够对食品被细菌污染的程度作出正确的评价,为各项卫生管理工作提供科学依据,提供传染病和人类,动物和食物中毒的防治措施。可以为制定正确、安全的加工、贮存、销售等提供科学依据,四、食品检测所涉及的类群,中国微生物已知物种数与世界已知物种数的比较,生物的已知种数和估计总种数,食品中常规指示菌和致病菌的关系,常规指示菌和致病菌的“危害分类”,食品微生物检验的任务和内容,食品微生物检验的指标就是根据食品卫生的要求，从微生物学的角度，对不同食品所提出的与食品有关的具体指标要求。我国卫生部颁布的食品微生物指标有菌落总数、大肠菌群和致病菌三项。菌落总数（个/1g、1cm、1cm2)：清洁状态的标志；
7、预测食品可能存放的期限.大肠菌群(MPN/100ml):较为理想的粪便污染的指标菌群；作为肠道致病菌污染食品的指示菌.致病菌(不得检出）：沙门氏菌、肉毒梭菌、志贺氏菌、变形杆菌、副溶血性弧菌、葡萄球菌、霉菌,霉菌及其毒素：我国还没有制定出霉菌的具体指标，鉴于有很多霉菌能够产生毒素，引起疾病，故应该对产毒霉菌进行检验。例如：曲霉属的黄曲霉、寄生曲霉等，青酶属的桔青酶、岛青酶等，镰刀酶属的串珠镰刀酶，禾谷镰刀酶等等。其它指标：微生物指标还应包括病毒，肝炎病毒、猪瘟病毒、鸡新城疫病毒、马立克氏病毒、口蹄疫病毒，狂犬病病毒，猪水泡病毒等；另外，从食品检验的角度考虑，寄生虫也被很多学者列为微生物检验的指
8、标：如旋毛虫，囊尾蚴，住肉孢子虫、蛔虫，肺吸虫，弓形体，螨，姜片吸虫，中华分枝睾吸虫等等。,第二部分 食品微生物检验的范围及检测指标,一、食品的特点：1、有丰富的营养物质 微生物进行正常的生理活动和生长繁殖,首先要有适当的营养条件,如碳源 氮源 无机盐类和生长素,碳源是构成菌体成分重要元素 2、含有一定量的水分 菌体所需的营养物质要成为水溶液状态才能被吸收 3、常具有天然防御结构和抑菌物质,二、微生物危害:,美国，每年约有7200万人发生食源性疾病，造成3500亿美元的损失,2001年，江苏、安徽等地，肠出血性大肠杆菌O157:H7，造成177人死亡，中毒人数超过2万人,1999年，宁夏，沙门
9、氏菌污染肉品，食物中毒暴发，发病人数上千人,80年代，上海，毛蚶，甲型肝炎爆发，累及30万人,三、食品微生物来源及污染途径,食品微生物来源：土壤、空气、水、人和动物 污染的途径是多方面的：土壤：粮食 蔬菜和水果等植物性食品是经土壤培育出来的，与土壤接触密切，最易受到土壤中微生物的污染。以细菌最多，其次是放线菌、霉菌与酵母菌。空气：在空气中，有时会出现一些病源微生物，如结核杆菌和金黄色葡萄球菌等病原菌，可通过污染的食品而引起感染。空气带有微生物的土壤、尘埃、痰沫与唾液播散到食品上，可造成食品的严重污染。,水：水是一种污染源，淡水中常见的微生物类群有：假单胞 菌属、无色杆菌属、黄杆菌属、产碱杆菌属
10、等菌种。海水中主要是副溶血弧菌，是人类吃海产品而引起食物中毒的病原菌水不仅是重要的污染源，而且还是食品被微生物污染的重要途径。人与动植物：人与动植物体表、人与动物的消化道和上呼吸道均有一定种类的微生物丛存在，该微生物如果污染了食品，常引起腐败变质。当人与动物有致病微生物侵入机体而致病时，体内的病原菌就会随粪便和分泌物排出体外，如处理不当，直接或间接污染食品，造成对人 的危害 工具与容器,四、食品微生物检验的范围,(1)生产环境的检验：车间用水、空气、地面、墙壁等。(2)原辅料检验：包括食用动物、谷物、添加剂等一切原辅材料。(3)食品加工、储藏、销售诸环节的检验：包括食品从业人员的卫生状况检验、
11、加工工具、运输车辆、包装材料的检验等。(4)食品的检验：重要的是对出厂食品、可疑食品及食物中毒食品的检验。,食品微生物检验的指标就是根据食品卫生的要求，从微生物学的角度，对不同食品所提出的与食品有关的具体指标要求。我国卫生部颁布的食品微生物指标有菌落总数、大肠菌群和致病菌三项。,五、食品微生物检验的指标,1.菌落总数,菌落(colony)：生长在固体培养基上，来源于一个细胞，肉眼可见的细胞群体。,菌落总数,定义：菌落总数是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后所得1g或1ml检样中所含细菌菌落的总数。卫生学意义：判定食品被细菌污染的程度及卫生质量。及时反映食品加工过程是否符合卫生要求，为被检食
12、品卫生学评价提供依据。通常认为，食品中细菌数量越多，则可考虑致病菌污染的可能性越大，菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。,2、大肠菌群,定义：大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。大肠菌群不是细菌学上的分类命名，而是根据卫生学方面的要求，提出的与粪便污染有关的细菌，即作为食品、水体等是否受过人畜粪便污染的指示菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。根据进一步的生化试验，可将这群细菌再分为大肠艾希氏菌（俗称大肠杆菌）、弗氏柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。,卫生学意义,大肠菌群和大肠杆菌是评价卫生质量的重要指标，作为食品中的粪便污
13、染指标。食品中检出大肠菌群，表明该食品有粪便污染，既可能有肠道致病菌存在，因而也就有可能通过污染的食品引起肠道传染病的流行。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。大肠杆菌在外界存活时间与一些主要肠道致病菌接近，它的出现预示着某些肠道病原菌的存在，因此该菌是国际上公认的卫生监测指示菌。近年来，有些国家在执行HACCP管理中，将大肠杆菌检测作为微生物污染状况的监测指标和HACCP实施效果的评估指标。,3、致病菌,致病菌既能够引起人们发病的细菌。对不同的食品和不同的场合，应该选择一定的参考菌群进行检验。例如：海产品以副溶血性弧菌作为参考菌群，蛋与蛋制品以沙门氏菌、金
14、黄色葡萄球菌、变形杆菌等作为参考菌群，米、面类食品以蜡样芽孢杆菌、变形杆菌、霉菌等作为参考菌群，罐头食品以耐热性芽孢菌作为参考菌群等等。,4、霉菌及其毒素,我国还没有制定出霉菌的具体指标，鉴于有很多霉菌能够产生毒素，引起疾病，故应该对产毒霉菌进行检验。例如：曲霉属的黄曲霉、寄生曲霉等，青酶属的桔青酶、岛青酶等，镰刀酶属的串珠镰刀酶，禾谷镰刀酶等等。,5、其它指标,微生物指标还应包括病毒，肝炎病毒、猪瘟病毒、鸡新城疫病毒、马立克氏病毒、口蹄疫病毒，狂犬病病毒，猪水泡病毒等；另外，从食品检验的角度考虑，寄生虫也被很多学者列为微生物检验的指标：如旋毛虫，囊尾蚴，住肉孢子虫、蛔虫，肺吸虫，弓形体，螨，
15、姜片吸虫，中华分枝睾吸虫等等。,第三部分 食品微生物学检测方法及程序,一、检测方法术语和定义标准方法：指国际、区域、国家发布的经过严格确认的以及公认的 方法。标准方法包括参考方法和公定方法。（1）参考方法：指适用于特殊待验目标的经过国际或国家公认的检验方法。对于食品微生物检验而言，典型的传统的参考方法是培养法。（2）公定方法：指知名的技术组织或机构（如AOAC）公布的检测方法。非标准方法：标准方法中未包含的需要确认后才能采用的方法。,可替代方法：指用来检验某一特定产品中某种目标微生物的与相应参考方法等效的方法（ISO 16140:2003），如快速检测试剂盒和自动化系统。值得说明的是，并非所有
16、的可替代方法都是标准方法。,食品微生物检测方法,二、检测技术及程序,从待检食品中分离微生物，是食品微生物学检验的第一步。要求：每一部操作过程中不再发生微生物的次生污染。,用于分离、培养微生物的器具事先不含任何微生物；在转接、培养微生物时防止其它微生物的污染；,一、无菌技术（aseptic technique）,获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵，无菌技术围绕着如何避免杂菌的污染展开。无菌技术：是指在研究微生物操作中，防止一切微生物侵入研究对象和防止无菌物品、无菌区域被污染的操作技术。,操作前准备,1 无菌技术操作原则,六步洗手法,掌心对掌心搓擦,掌手心指对交手错背搓擦,手指交错掌心对掌心
17、搓擦,两手互握互搓指背,拇指在掌中转动搓擦,指心在掌心中摩擦,1,2,3,4,5,6,操作中保持无菌,无菌物品保管,2 微生物培养的常用器具及其灭菌,常用的器具：试管、瓶子、培养皿等,(culture dish)Petri dish,常用的灭菌方法：高压蒸汽灭菌高温干热灭菌,高压灭菌锅,烘箱,3 培养基的除菌 根据培养基的特点采用不同的除菌方式，包括物理、化学以及生物除菌的方法。,4 接种在无菌箱（超净工作台）或操作室内无菌的环境下进行。,超作时注意的问题,工作区域？,接种操作：火焰附近（酒精灯、煤气灯）进行,示意图：,二、检测基本程序,样品的采集样品种类样品种类可分为大样、中样、小样三种。大
18、样系指一整批，中样是从样品各部分取得的混合样品，小样系指做分析用，称为检样。检样一般以25g为准，中样以200g为准。采样用具：如探子、铲子、匙、采样器、试管、广口瓶、剪子和开罐器等，必须是灭菌的。,采样方式：,根据样品种类如袋、瓶和罐装者，应取完整的未开封的。如果样品很大，则需用无菌采样器取样；样品是固体粉末，应边取边混合；样品是液体的，通过振摇即可混匀；检样是冷冻食品，应保持在冷冻状态(可放在冰内、冰箱的冰盒内或低温冰箱内保存)，非冷冻食品需保持在05中保存。采样标签：采样前或后应立即贴上标签，每件样品必须标记清楚(如品名、来源、数量、采样地点、采样人及采样年、月、日)。,送检,样品送到食
19、品卫生微生物检验室应越快越好，一般应不超过3h。如果路途遥远，可将不需冷冻样品保持在15环境中(如冰壶)。如需保持冷冻状态，则需保存在泡沫塑料隔热箱内(箱内有干冰可维持在0以下)。送检时，必须认真填写申请单，以供检验人员参考。,检验,食品卫生微生物检验室接到送检申请单，应立即登记，填写实验序号，并按检验要求，立即将样品放在冰箱或冰盒中，积极准备条件进行检验。各食品卫生微生物检验室必须备有专用冰箱存放样品。一般阳性样品，发出报告后3d(特殊情况可适当延长)始能处理样品。进口食品的阳性样品，需保存6个月，方能处理。阴性样品可及时处理。,报告,检验完后，检验人员应及时填写报告单，签名后，送主管人员核
20、实签字，加盖单位印章，以示生效，立即交食品卫生监督人员处理。,三、检测过程中的技术及注意,分离前的准备 A：培养基制备,培养基（形态分）：,液体培养基；固体培养基；半固体培养基；,B：无菌取样,样品预处理（如均质),C 样品的稀释:使微生物在固体培养基平板上形成单个菌落的基本方法.,2 分离方法,2.1 用固体培养基分离纯培养方法：稀释倒平板法涂布平板法平板划线分离法稀释摇管法（用于厌氧菌的培养,稀释倒平板法:操作较麻烦，对好氧菌、热敏感菌效果不好！,涂布平板法:使用较多的常规方法，但有时涂布不均匀！,使用移液管时注意问题？,涂布示意图：,稀释倒平板法:操作较麻烦，对好氧菌、热敏感菌效果不好！
21、,Steps in loop dilution,平板划线法：,原理示意图,划线操作：,图-4，A：用接种环以无菌操作挑取 土壤悬液一环，先在平板培养基的一边作第一次平行划线3-4条，再转动培养皿约70角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同法通过第二次平行划线部分作第三次平行划线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线。划线完毕后，盖上皿盖，倒置于温室培养。,图-4，B 将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连续划线。划线完毕后，盖上皿盖，倒置温室培养。,恒温培养,结果观察,菌落总数的测定平板菌落计数法 程序,操作要点,将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基置于45 恒温
22、水浴锅中保温备用。编号:无菌试管（10-1、10-2、10-3、10-4。）、无菌培养皿、空白对照平板稀释菌液：摇匀平板：平板前后、左右或者以顺时针、逆时针。倒置培养,菌落计数统计,应选择平均菌落数在30300之间的稀释度，乘以稀释倍数报告；如有两个稀释度，其生长的菌落数均在30300之间，视两稀释液测定值之比来决定，如其比值小于2，应报告其平均数；如大于2，则报告其中较小的数字；如所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告；如所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告；如所有稀释度均无菌落生长，则以小于乘以最低稀释倍数报告；如所有稀释度的平均菌落数均不在30300之间，其中一部分大于300或小于30时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告。,菌落总数记录报告,Thanks！,
