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1、食品微生物检验,一、微生物检测工作的意义,据世界卫生组织估计，在全世界每年数以亿计的食源性疾病患者中，70是由于食用了各种致病性微生物污染的食品和饮水造成的。2000年至2002年，中国疾病预防控制中心营养与食品安全所对全国部分省市的生肉、熟肉、乳和乳制品、水产品、蔬菜中的致病菌污染状况的监测结果表明，微生物性食物中毒仍居首位，占39.62；化学性食物中毒占38.56；动植物性和原因不明的食物中毒均占10左右。,传统的微生物检测方法，主要包括形态检查和生化方法，涉及的实验较多、操作繁琐、需要时间较长、准备和收尾工作繁多。1955年德国学者 发明了一种简单快速的大肠菌群快速检测法纸片法，使原来的
2、检测周期由72小时缩短到15小时，材料成本降低了四分之三，同时大大简化了操作程序。从此，这种生化检测方法开始发展起来。另外，将培养基固化在试剂盒中的速测盒法，也是一种较为简洁快速的检测方法，省去了大量的实验准备工作。,二、开展微生物检测所需的基本条件,无菌室（含紫外灯等消毒设备的隔离空间）；恒温培养箱；微生物检测设备、器皿、试剂等；高压灭菌锅；（灭菌是否彻底）具备以上设备和无菌操作概念即可进行检测了。,灭菌彻底与否指示,灭菌指示胶带（3M）生物指示（嗜热脂肪芽孢杆菌 121.1）,紫外灯相关,强度：对室内空气的消毒，直接照射法：采用室内悬吊式紫外线消毒时，室内安装紫外线消毒灯（30紫外灯，在1
3、.0m 处的强度 70W/cm2）的数量为平均每立方米不少于 1.5W，照射时间不少于30min。更换频率：紫外线灯使用过程中其辐照强度逐渐降低，故应定期测定消毒紫外线的强度，一旦降到要求的强度以下时，应及时更换。紫外线消毒灯的使用寿命，即由新灯的强度降低到70W/cm2 的时间(功率30W)，或降低到原来新灯强度的 70%（功率 30）的时间，应不低于 1000h。紫外线灯管有高硼玻璃和石英玻璃之分，由于高硼玻璃的UV254nm紫外线透过率只有50%左右，一般只有1000小时；石英是紫外线透过率最高的材料，普通石英可以透过UV254的80%以上，石英玻璃紫外线灯寿命一般大于6000小时，进口
4、的紫外线灯可以到8000h以上，部分厂家可以达到1200小时。紫外线强度计至少1年标定1次。,紫外线辐照时间计算,照射剂量和时间：不同种类的微生物对紫外线的敏感性不同，用紫外线消毒时必须使用照射剂量达到杀灭目标微生物所需的照射剂量。杀灭一般细菌繁殖体时，应使照射剂量达到10 000W.s/cm2；杀灭细菌芽孢时应达到100 000W.s/cm2；病毒对紫外线的抵抗力介于细菌繁殖体和芽胞之间；真菌孢子的抵抗力比细菌芽孢更强，有时需要照射到600 000W.s/cm2，但一般致病性真菌对紫外线的抵抗力比细菌芽胞弱；在消毒的目标微生物不详时，照射剂量不应低于100 000W.s/cm2。辐照剂量是所
5、用紫外线灯在照射物品表面处的辐照强度和照射时间的乘积。因此，根据紫外线光源的辐照强度，可以计算出需要照射的时间。例如，用辐照强度为 70W/cm2 的紫外线表面消毒器近距离照射物品表面，选择的辐照剂量是 100 000W.s/cm2，则需照射的时间是：100 000W.s/cm2 70W/cm2=1429 s 60s 24min。,1、概念的理解无菌是指物体中没有活的微生物存在。防止微生物进入人体或物体的操作方法，称为无菌技术或无菌操作。关键点：人：操作前洗手更衣等物：试剂器械环境：无菌室,三、无菌操作和注意事项,四、革兰氏染色,革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884年由丹麦
6、医师、细菌学家 Christain Gram创立。步骤：a.将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染液，染1min，水洗。b.滴加革兰氏碘液，作用lmin，水洗。c.滴加95%乙醇脱色约15-30s，直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗。d.滴加复染液，复染lmin，水洗、待干、镜检。,原理：细菌先经碱性染料结晶紫染色，而经碘液媒染后，用酒精脱色，在一定条件下有的细菌此色不被脱去，有的可被脱去，因此可把细菌分为两大类，前者叫做革兰氏阳性菌（G+），后者为革兰氏阴性菌（G）。G菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。呈紫色。G菌：
7、肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，番红染液复染后呈红色。革兰氏阳性菌：葡萄球菌属（主要是金黄色葡萄球菌）、蜡样芽孢杆菌、单增李斯特氏菌等；革兰氏阴性菌：埃希氏菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属（痢疾杆菌等）、霍乱弧菌、副溶血性弧菌等。,五、BSL简介,biology security level(BSL):生物安全水平 根据所用病原微生物的危害程度、对人和动物的易感性、气溶胶传播的可能性、预防和治疗的可行性等因素，其实验室生物安全水平共分为四级，一级最低，四级最高。一级生物安全水平（BSL-1）：能够安全操作，对实验室工作
8、人员和动物无明显致病性的，对环境危害程度微小的，特性清楚的病原微生物的生物安全水平。二级生物安全水平（BSL-2）：能够安全操作，对实验室工作人员和动物致病性低的，对环境有轻微危害的病原微生物的生物安全水平。如：大肠埃希氏菌,三级生物安全水平（BSL-3）：能够安全地从事国内和国外的，可能通过呼吸道感染，引起严重或致死性疾病的病原微生物工作的生物安全水平。如：炭疽芽孢杆菌、鼠疫杆菌、结核分枝杆菌、狂犬病毒 四级生物安全水平（BSL-4）：能够安全地从事国内和国外的，能通过气溶胶传播，实验室感染高度危险，严重危害人和动物生命和环境的，没有特效预防和治疗方法的微生物工作的生物安全水平。与上述相近的
9、或有抗原关系的，但尚未完全认识的病原体也应在此种水平条件下进行操作，直到取得足够的数据后，才能决定是继续在此种安全水平下工作还是在低一级安全水平下工作。如：埃博拉病毒、马尔堡病毒、天花病毒,六、提高检测速度的一些方法,一、设备更新：移液管、吸球/移液器普通高压蒸汽灭菌器/全自动高压蒸汽灭菌器搅拌器或匀浆机/拍击式均质器,二、采用快速检测方法进行粗筛纸片法快速检测试剂盒,测试片检测结果图像,七、常见微生物检测设备,Biolog微生物鉴定数据库容量是目前世界上最大的，可鉴定包括细菌、酵母和丝状真菌在内总计1973种微生物，涵盖了所有的人类、动物、植物病原菌以及食品和部分环境微生物，其中细菌234个
10、属，1 226个种。,Biolog全自动快速微生物鉴定仪,原理：Biolog自动微生物分析系统主要根据细菌等95种碳源的利用情况,配合四唑类显色物质进行鉴定。,分子生物学细菌鉴定,1.16S rRNA分析 2.特异片段扩增3.DNA指纹技术（RFLPDNA的限制 性片段长度多态性,RAPD-随机扩增多态性),PCR仪,BD Phoenix System“凤凰”全自动细菌/鉴定药敏系统,1概况1998年Becton Dickinson and Company公司Phonenix全自动细菌鉴定药敏系统,原理 采用荧光增强原理与传统酶、底物生化呈色反应结合。（菌种库270种细菌）,MicroScan
11、微生物自动鉴定及药敏系统,概况 MicroScan自动细菌鉴定系统包括半自动系列AutoScan-4以及全自动系列Walkaway 40/96。是美国最普遍使用的鉴定系列之一。,原理 将荧光物质均匀地混在培养基中，菌种接种到鉴定板，通过检测荧光底物的水解、底物被利用后的pH变化，特殊代谢产物的生成和某些代谢产物的生成率来进行菌种鉴定。,原理：采用传统生化反应，8进位数码鉴定及荧光分析相结合。荧光分析是用荧光标记细菌表面特异酶的底物，经细菌水解底物产生荧光来判断结果,Sensititre(自动荧光法微生物鉴定药敏分析系统）,AutoReader,ARIS（可以自动孵育）,VITEK,VITEK-ATB(半自动微生物鉴定和药敏系统)Vitek-AMS（全自动细菌鉴定和药敏分析系统）Vitek II,VIDAS,原理：VIDAS(bioMerieux Vitek公司)是应用酶联免疫荧光试验(ELFA)检测食品中的病原菌。即用荧光标记后的抗体检测特异性的抗原(沙门氏菌、李斯特菌、葡萄球菌毒素、EColi O157和单核细胞增生李斯特氏菌),FDA认可使用的检测系统,就到这里！谢谢大家！,
