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1、第三章 培养基和实验基本操作技术,第一节 培养基,一、培养基中的主要成分及其作用,（一）、营养物质 N源、C源、无机盐、生长因子、水,蛋白胨牛肉膏肉浸汁酵母膏,1、常用的N源物质,（1）蛋白胨,有：普通蛋白胨示胨胰蛋白胨,（2）牛肉浸液,成份：含氮物：肌酸、嘌吟、核苷酸尿酸肌肽等 糖类物质：葡萄酒3肝糖、P-已糖 生长因子：硫胺、核黄素、泛酸、叶酸等8种B族维生素,（3）组织浸液,组织浸液，主要为微生物生长繁殖提供可溶性含氮物质、核酸降解物、维生素及无机盐等，补充蛋白胨营养成分的不足部分。包括动物组织浸液、植物组织浸液、微生物细胞浸液。,2、糖、醇类物质,单糖：葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖双糖
2、：蔗糖、麦芽糖、乳糖多糖：淀粉、纤维素、菊糖 醇类：甘露醇、卫茅醇、甘油,（二）、水,用蒸馏水，不能用自来水,（三）、凝固剂,琼脂、明胶、血清等 要求：清一色、杂质少,（四）、抑制剂,1、作用：鉴定细菌、抑制杂菌的生长繁殖，增加待检菌的检出率2、种类：盐类：氯化钠、氯化锂、氰化钾、亚碲酸钾（钠）、亚硒酸钠等染色剂类：煌绿、蔷薇酸、结晶紫、孔雀绿、孟加拉红、玫瑰红胆盐类：猪（牛、羊）胆盐、混合胆盐、三号胆盐、去氧胆酸盐、胆石酸盐抗菌素：青霉素、链霉素、杆菌肽、多粘菌素,（五）、指示剂,1、作用：用于指示鉴别细菌可否利用分解糖醇类物质和含氮化合物，产酸产碱的能力。2、常用的指示剂：酚红、溴甲酚紫、
3、中性红、中国蓝、甲基红、复红、伊红、美蓝、孔雀绿等,二、培养基的类型,在实验室中配制的适合微生物生长繁殖或累积代谢产物的任何营养基质，都叫做培养基(Media)。由于各类微生物对营养的要求不同，培养目的和检测需要不同，因而培养基的种类很多。我们可根据某种标准，将种类繁多的培养基划分为若干类型。,（一）、根据培养基的物理状态来区分,固体培养基液体培养基半固体培养基,主要用于增菌培养、鉴别性培养。,1、液体培养基,2、固体培养基,用作微生物的分离、鉴定、检验杂菌、计数、保藏、生物测定等,3、半固体培养基,观察微生物的动力，有时用来保藏菌种。,增殖培养基选择培养基鉴别培养基,（二）、根据培养基的用途
4、来区分,1、增殖培养基,在普通培养基中加入一些某种微生物特别喜欢的营养物质，以增加这种微生物的繁殖速度，逐渐淘汰其它微生物，这种培养基称为增殖培养基。,增菌、运送用培养基,2、选择培养基,在培养基中加入某种物质以杀死或抑制不需要的菌种生长的培养基，称之为选择培养基。,分离培养用的培养基,3、鉴别培养基,在培养基中加入某种试剂或化学药品，使难以区分的微生物经培养后呈现出明显差别，因而有助开快速鉴别某种微生物。这样的培养基称之为鉴别培养基。,鉴别用培养基,（三）培养基制备的基本方法和注意事项,培养基的制备记录 培养基成分的称取 培养基各成份的混合和溶化 培养基pH的初步调正 培养基的过滤澄清 培养
5、基的分装培养基的灭菌培养基的质量测试培养基的保存,1、培养基的制备记录,每次制备培养基均应有记录，包括培养基名称，配方及其来源，和各种成份的牌号，最终pH值、消毒的温度和时间制备的日期和制备者等。记录应复制一份，原记录保存备查，复制记录随制好的培养基一同存放、以防发生混乱。,2 培养基成分的称取,培养基的各种成分必须精确称取并要注意防止错乱，最好一次完成，不要中断。可将配方置于傍侧，每称完一种成分即在配方上面做出记号，并将所需称取的药品一次取齐，置于左侧，每种称取完毕后，即移放于右侧。完全称取完毕后，还应进行一次检查。,3 培养基各成份的混合和溶化,指示剂应在调节好PH值后再加入；煮溶后要补加
6、足水份；不能把培养基煮焦，焦化的不能使用。,4 培养基pH的校正,灭菌后PH值会下降0.10.2，在做培养基校正PH值时，应比实际值高0.10.2；PH调整后，还应将培养基煮沸。,液体培养基可用滤纸过滤法 琼脂培养基,可用中间夹有薄层吸水棉的双层纱布过滤,5 培养基的过滤澄清,培养基的分装,斜面：1/管半固体培养基：1/3管 高层斜面：1/41/3管 平板：1315ml,7 培养基的灭菌,（1）含糖类或明胶的培养基：113灭菌15分钟或115灭菌10分钟。（2）无糖培养基：121灭菌1520分钟。（3）血液、体液和抗生素等以无菌操作技术抽取后再加入冷却至约50左右的培养基中。（4）琼脂斜面培养
7、基应在灭菌后冷至55-60时取出，再摆置成适当斜面。,8 培养基的质量测试,（）如发现破裂、水分浸入、色泽异常、棉塞被培养基沾染等、均应挑出弃去。并测定其最终pH。（）将全部培养基放入361C恒温箱培养过夜，如发现有菌生长，即弃去。（）用有关的标准菌株接种12管或瓶培养基，培养2448小时，如无菌生长或生长不好。应追查原因并重复接种一次，如结果仍同前，则该批培养基即应弃去，不能使用。,9 培养基的保存,（1）基础培养基不能超过两周（2）生化试验培养基不宜超过一周，（3）选择性或鉴别性培养最好当天使用，倾注的平板培养基不宜超过3天。,培养基、玻璃器皿天平秤、药匙,杀菌锅(Autoclave),无
8、菌操作台(Laminar flow),以量桶裝取適當量蒸馏水於玻璃容器中 於玻璃容器上标示培养基名称,放上秤藥紙並歸零 以秤藥匙舀出適當量培養基(請看培養基罐上說明),傾倒培養基時小心不要沾到玻璃壁上,培養基配製 溶解培養基,清理配藥桌面與天平 清洗秤藥匙，擦乾放回 藥品放回藥品櫃,注意事項 配藥結束,調整分注器 刻度 分裝試管 蓋上試管蓋,培養基配製 分裝,放入杀菌锅(Autoclave)灭菌,培養基配製 灭菌,加水蓋過鐵板,放東西,關門,調整溫度時間,關緊洩壓閥,注意事項 杀菌锅的使用,滅菌結束後，等壓力降回零時才可打開門,進入殺菌釜 之物品，蓋子不可關太緊或太鬆,注意事項 殺菌釜使用,拿
9、滅菌後物品請記得帶耐熱手套,注意事項 殺菌釜使用,第二节、微生物检验的基本操作技术,主要内容,无菌技术M的接种与分离技术微生物的培养方法微生物的生长现象与观察,一、无菌技术,（一）什么是无菌技术,指在微生物实验工作中，控制或防止各类微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施。,（二）无菌环境,无菌室无菌柜超净工作台,1、无菌室,（1）无菌室的结构：更衣间、缓冲间、操作间（2）无菌室的消毒和防污染每日（使用前）紫外线照射（12小时）.每周用甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2小时）.每月用新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒。,2、超净工作台,超净台的使用与保养:（1）风速保持在米/秒;（2）使
10、用前开启紫外灯照射30分钟以上;（3）让超净台预工作1015分钟;（4）使用完毕后，用70%酒精将台面和台内四周擦拭干净.,（三）无菌器材,灭菌器材：玻璃器皿、培养基、无菌衣等.消毒器材：无菌室内的凳子、试管架、天平、工作台、手等,（四）无菌操作,1、目的：（1）是保证待检物品不被环境中微生物的污染；（2）是防止被检微生物在操作中污染环境或感染操作人员。,2、进入无菌室前的准备,（1）、定期检查无菌环境的空气是否符合规定；（2）、用紫外线灭菌处理3060分钟；（3）、检查无菌器材是否完备；（4）、洗手消毒；（5）、手部消毒后，再穿戴无菌工作服。,3、检验操作过程的无菌操作要求,（1）在操作中不
11、应有大幅度或快速的动作；（2）使用玻璃器皿应轻取轻放。（3）在正火焰上方操作；（4）接种用具在使用前、后都必须灼烧灭菌；（5）在接种培养物时，协作应轻、准。（6）不能用嘴直接吸吹吸管。（7）带有菌液的吸管、玻片等器材应及时置于盛有5%来苏尔溶液的消毒桶内消毒。,无菌操作,斜面接种时的无菌操作(1)接种灭菌(2)开启棉塞(3)管口灭菌(4)挑起菌苔(5)接种(6)塞好棉塞,1.接種環前端鐵絲部分以酒精燈烧红来菌，後端鐵棒部分過火,无菌操作 取菌技巧 1,2.試管前端過火,3.打開試管蓋,无菌操作 取菌技巧 1,4.試管傾斜，放入接種環,無菌操作 取菌技巧 1,5.試管前端過火，蓋上試管蓋,6.接
12、種環燒紅滅菌,无菌操作 取菌技巧 1,2.自 Plate 上取單一菌落(方法一：蓋子微開遮住培養基，避免空氣中菌體掉入),(方法二：plate 反面拿起),无菌操作 取菌技巧 2,1.擠出安全吸球內空氣，插上滅過菌之玻璃吸管,2.向上為吸，向下為放,无菌操作 取菌技巧 3,1.調整 Pipetman 刻度(P1000 吸取範圍 200 1000l),2.插上滅過菌之 Tip(用力插緊),无菌操作 取菌技巧 4,3.按鈕壓至第一段(不可壓至最底),4.深入液面下 2 4 mm,无菌操作 取菌技巧 4,无菌操作 取菌技巧 4,1.試管前端過火,2.打開試管蓋,无菌操作 接菌技巧,方法一：以接種環沾
13、菌，放入新的培養基中接菌,方法三：以Pipetman 吸取菌液，按鈕壓至最底排出菌液,方法二：以安全吸球吸取菌液，放入新的培養基中，向下排出菌液,无菌操作 接菌技巧,操作時離火源遙遠,試管直放，空氣中菌體容易掉入,無菌操作 錯誤示範,安全吸球倒放，菌液容易流入吸球內,安全吸球隨意放置桌面，菌液容易流出至桌上,無菌操作 錯誤示範,Pipetman 倒放，菌液容易流入 Pipetman 內,無菌操作 錯誤示範,生物性廢棄物放至正確位置以便滅菌,注意事項 生物性廢棄物,二、微生物的接种与分离技术,（一）、接种,将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。,、接种工具和方法,
14、接种和分离工具1接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀,常用的接种方法有以下几种：,）划线接种）三点接种）穿刺接种）浇混接种,）涂布接种）液体接种）注射接种）活体接种,(二)、分离纯化,、倾注平板法,、涂布平板法,倾注平板法（a）涂布平板法（b）图解1.菌悬液 2.熔化的培养基 3.培养物 4.无菌水,、平板划线法,平板划线分离法1.斜线法 2.曲线法 3.方格法 4.放射法 5.四格法,平板划线法：1、倒平板，标记培养基名称，编号和实验日期。2、划线方法 稀释混合平板法：1、先加菌 2、倒平板时注意培养基温度 3、混合均匀,三、微生物的培养方法
15、,一般培养法（需氧培养）厌氧培养法CO2培养法,（一）、一般培养法（需氧培养）,培养温度:2537,（二）、厌氧培养方法,1、简易的厌氧培养法：（1）庖肉培养法（2）铁丝圈厌氧培养法（3）焦性没食子酸法2、厌氧罐法3、厌氧手套箱法,A、厌氧缸法,厌氧缸是普通的干燥缸，用物理化学的方法使缸内造成厌氧环境，从而将厌氧菌培养出来。接种好标本的平板或液体培养基试管，可放入厌氧缸内培养。,B、厌氧罐法,使用：装入待培养的对象，然后密闭罐盖，接着可采用抽真空灌氮抽真空灌氮抽真空灌混合气(N2CO2H2=801010，V/V)。,C、厌氧手套箱,（三）、二氧化碳培养法,1、烛缸法：2、二氧化碳置換法3、化学
16、法：每一升用重碳酸钠0.4克与浓盐酸0.35亳升加入4、二氧化碳培养箱法,二氧化碳培养箱,二氧化碳培养法,四、微生物培养特性观察与记录,在固体培养基上，观察：菌落大小、形态、颜色（色素是水溶性还是脂溶性）、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特征及迁移性等；在液体培养中：表面生长情况（菌膜、环）混浊度及沉淀等。半固体培养基穿刺接种：观察运动、扩散情况。,1.点状 2.圆形 3.丝状 4.不规则形 5.假根状 6.纺锤状 7.扁平 8.隆起 9.凸起 10.垫状 11.脐状 12.边缘整齐 13.波状 14.裂片状 15.啮蚀状 16.丝状 17.卷发状 18.丝线状 19.刺毛状 20.串珠状 21.疏展状 22.树根状 23.假根状 24.丝状 25.串珠状 26.乳头状 27.绒毛状 28.树根状 29.量杯状 30.萝卜状 31.漏斗状 32.囊状 33.层状 34.絮状 35.环状 36.蹼状 37.膜状,思考题1、什么是无菌技术？2、如何做好无菌室的消毒和防污染工作？3、如何做好超净台的使用与保养？4、无菌操作的目的是什么？5、进入无菌室前要做好哪些准备工作？6、验操作过程的无菌操作要求包括哪些内容？,
