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1、现代生物科技专题,1.2基因工程的基本操 作 程 序,目的基因的获取,基因表达载体的构建,将目的基因导入受体细胞,目的基因的表达和检测,基因工程的基本操作程序,1、从基因文库中获取,(基因序列未知),基因文库,基因组文库：,部分基因文库如：cDNA文库,一.目的基因的获取,包含一种生物的全部基因,包含一种生物的部分基因,图书馆,国家图书馆,市图书馆,基因文库,基因组文库,部分基因文库,限制酶,基因组DNA,基因重组,转化细菌,体外包装,基因组文库(Genomic library),是指将某种生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段，再与合适的载体在体外重组
2、后，导入受体菌的群体中储存，这个群体就称为该生物基因组文库。其目的是分离有用的目的基因和保存某种生物的全部基因。,cDNA(互补DNA)：是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经体外反转录后形成的互补DNA片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，这个受体菌群就叫做这种生物的cDNA文库,cDNA文库(cDNA library),反转录酶,mRNA,cDNA,依据：目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能 基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质等特性,从基因文库中得到目的基因的方法,2、利用PCR技术扩增目的基因,PCR技术：聚合酶链式反应
3、,目的：扩增DNA,高温变性,5/,3/,5/,3/,90-95,55-65,70-75,过程：,a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板 在热作用下，_断裂，形成_,b、复性（55-65）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,PCR扩增仪,概念：PCR全称为_，是一项 在生物_复制_的核酸合成技术,条件：_、_、_、_.等,原理：_,方式：以_方式扩增，即_（n为扩增循 环的次数）,结果：,聚合酶链式反应,体外,特定DNA片段,DNA复制,四种脱氧核苷酸,引物,DNA聚合酶
4、,指数,2n,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增,要有一段已知核苷酸序列的目的基因,PCR技术,3、人工合成,(基因比较小，序列已知),DNA合成仪,1）反转录法：,cDNA(互补DNA),蛋白质,mRNA,DNA,DNA,2）根据已知的氨基酸序列合成DNA法：,二 基因表达载体的构建,基因表达除含有目的基因外，还需要哪些元件：,启动子终止子标记基因,1.基因表达载体的组成,细胞的基因结构,与RNA聚合酶结合位点,RNA聚合酶是一种蛋白质，能识别并与调控序列中的结合位点结合，能催化DNA转录为RNA,启动子,终止子,启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合
5、的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止DNA的转录起始密码子？终止密码子？,细胞的基因结构,与RNA聚合酶结合位点,RNA聚合酶,RNA聚合酶,启动子,终止子,基因表达载体的组成：,目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。,基因表达载体的构建,a、目的基因,b、启动子,c、终止子,d、标记基因,e、复制原点,质粒,DNA分子,一个切口两个黏性末端,两个切口获得目的基因,DNA 连接酶,重组DNA分子（重组质粒）,同一种 限制酶,目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源
6、的基因重组的过程。,2 基因表达载体的构建过程,三 将目的基因导入受体细胞,转化,目的基因进入受体细胞内，并且在 受体细胞内维持稳定和表达的过程。,将目的基因导入受体细胞,农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法,受体细胞,植物细胞,动物细胞,原核细胞,显微注射技术,感受态法,1 农杆菌转化法,适用于双子叶植物裸子植物,适用于单子叶植物,基因枪法,胚珠,花药,花丝,柱头,花柱,子房壁,子房,雄蕊,雌蕊,花粉管通道法,适用于被子植物,2将目的基因导入动物细胞方法：显微注射法程序：,目的基因表达载体提纯 取卵（受精）显微注射 受精卵 新性状动物,3将目的基因导入微生物细胞原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传
7、物质少方法：,用Ca2+处理细胞 感受态细胞 表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收DNA分子,4 目的基因的表达和检测,接种实验,抗原抗体杂交法,DNA-RNA分子杂交法,DNA分子杂交法,DNA分子杂交,采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。,A-,A-,T-,T-,C-,G-,T-,探针,待测DNAX,待测DNAY,待测DNAY与探针DNA相同,检测目的基因是否导入受体细胞,目的DNA片段,目的基因,蛋白质,小鼠体内,抗体,目的基因,
8、受体细胞,蛋白质,抗原,杂交分子,检测目的基因是否翻译成蛋白质,-抗原抗体杂交,具体做法是：第一步，将目的基因在大肠杆菌中表达出蛋白质；第二步，将表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出抗体（一抗）；第三步，从转基因生物中提取蛋白质，走凝胶电泳；第四步，将凝胶中的蛋白转移到硝酸纤维素膜上；第五步，将抗体（一抗）与硝酸纤维素膜上的蛋白杂交，这时抗体（一抗）与目的基因表达的蛋白（抗原）会特异结合。由于这种抗原抗体的结合显示不出条带，所以加入一种称为二抗的抗体，它可以与一抗结合，二抗抗体上带有特殊的标记。如果目的基因表达出了蛋白质，则结果为阳性。,检测目的基因是否翻译成蛋白质,-抗原-抗体杂交,个体生物学水平,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,归纳:基因工程的基本操作程序,获取目的基因从基因文库利用PCR化学方法人工合成构建基因表达载体目的基因、启动子、终止子、标记基因将目的基因导入受体细胞农杆菌转化法、显微注射法、感受态法目的基因的检测与鉴定检测：是否插入、转录、翻译鉴定：,
