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1、第九章 高压液相色谱,高压液相色谱（High Performance Liquid Chromatograph 简称HPLC）又称高速或高效液相色谱,1）吸收了普通液相层析和气相色谱的优点；2）它既有普通液相层析的功能（可在常温下分离制备水溶性的物质），又有气相色谱的特点（即高压、高速、高分辨率和高灵敏度）；3）适用于很多不易挥发，难热分解物质（如金属离子、蛋白质、肽类、氨基酸及其衍生物、核苷、核苷酸、核酸、单糖、寡糖和激素等）的定性和定量分析及其制备和分离。,优点：,现代高效液相色谱法的特点：,1）高压：工作压力高达20MPa30MPa2）高速：分离一个样品只需几分钟至几十分钟3）高效：塔板
2、数可达约3万塔板/米，使分离效率大大提高4）高灵敏度：UV检测器的检测限达10-9g，荧光检测器的灵敏度可达10-11g,快速蛋白液相色谱（Fast Protein Liquid Chromatograph FPLC）,能在惰性条件下，以极快的速度把复杂的混合物通过成百上千次层析分开。如果连续进样，一天内可制出大量的欲纯化物质。,按其固定相的性质可分：,高效凝胶色谱疏水性高效液相色谱反相高效液相色谱高效离子交换液相色谱高效亲和液相色谱高效聚焦液相色谱原理与相对应的普通液相层析的原理相似。其不同：高效液相色谱灵敏、快速、分辨率高、重复性好，且须在色谱仪中进行。,LC-MS液质联用仪,液质联用技术
3、现已发展成为最重要的定性、定量分析方法之一，在生物、医药、化工、农业和环境等领域中均得到了广泛的应用，在组合化学、蛋白质组学和代谢化学的研究工作中，液质已经成为最重要的研究方法之一。,高效液相色谱仪主要有：进样系统输液系统分离系统检测系统数据处理系统,高效液相色谱,溶剂输送系统（高压泵）进样系统（进样阀）分离系统（色谱柱）检测系统（检测系统）,1.进样系统,采用隔膜注射进样器高压进样阀进样进样量恒定，有助于提高分析样品的重复性,2.输液系统,高压泵、流动相贮存器和梯度仪高压泵的压强为1.47-4.4107 Pa优点：流速可调且稳定，高压流动相通过柱层析，可降低样品在柱中的扩散效应，可加快其在柱
4、中的移动速度，可提高分辨率、回收样品、保持样品的生物活性。,高效液相色谱的流动相要求：,1）应具有足够的纯度，选用色谱纯试剂2）流动相与固定液应互不相溶3）流动相对试样各组分应有适当的溶解度4）粘度小5）检测器对流动相不产生响应,流动相贮存器和梯度仪，可改变洗脱液的极性、离子强度、pH值、或改用竞争性抑制剂或变性剂等。使各种物质（即使仅有一个基团的差别或是同分异构体）都能获得有效分离。,采用梯度洗脱，可以提高分离效果 梯度洗提脱：在分离的过程中，应用梯度洗提装置，按一定的程序改变两种或两种以上不同极性的溶剂之间的比例，使流动相的成分和极性产生相应的变化，从而改变样品中不同极性的组分的相对保留值
5、，提高分离效果，加快分析速度。,3.分离系统,包括色谱柱、连接管和恒温器等。色谱柱长度为10-50cm（需要两根连用时，可在二者之间加一连接管）。内径为2-5mm。由优质不锈钢或厚壁玻璃管或钛合金等材料制成，柱内装有直径为5-10m粒度的固定相（由基质和固定液构成）。,固定相中的基质是由机械强度高的树脂或硅胶构成。特点：惰性（如硅胶表面的硅醇基团基本已除去）多孔性（孔径可达1000）比表面积大其表面经过机械涂渍或用化学法偶联各种基团（如磺酸基、季胺基、羟甲基、苯基、氨基或各种长度碳链的烷基等）或配体的有机化合物，对结构不同的物质有良好的选择性。,基质粒度小，能提高分辨率：固定相基质粒度小，柱床
6、易达到均匀、致密状态，易降低涡流扩散效应，微孔浅，样品在微孔区内传质短，能缩小谱带宽度、提高分辨率。,根据柱效理论（即塔板理论数N与理论塔板高度H成反比，而H与颗粒度的平方成正比）分析，基质粒度越小，塔板理论数N就越大，分辨率也越高。另外，高效液相色谱的恒温器可使温度从室温调到60，改善传质速度、缩短分析时间，增加层析柱的效率。,色谱柱常用内壁抛光过的不锈钢制成标准柱型：内径为4.6mm 或 3.9mm，长为15cm-30cm 的直形不锈钢柱 填充柱的方法：干法和湿法 颗粒直径大于20m的可用干法填充 颗粒直径10m以下的采用湿法装柱湿法装柱每米柱效可达3万塔板,色谱柱由柱管、压帽、卡套（密封
7、环）、筛板（滤片）、接头、螺丝等组成,柱的使用和维护注意事项：色谱柱的正确使用和维护十分重要，否则会降低柱效、缩短寿命甚至损坏。需要维护色谱柱：避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。应逐渐改变溶剂的组成，特别是反相色谱中，不应直接从有机溶剂改变为全部是水，反之亦然。,一般色谱柱不能反冲，若标明该柱可反冲，可用反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。选择使用适宜的流动相（尤其是pH），以避免固定相被破坏。可以在进样器前面连接一预柱，可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶“饱和”，避免分析柱中的硅胶基质被溶解。,避免将组成复杂的样品直接注入柱内，需对样品进行预处理，或在进样器和色谱柱之间连
8、接一保护柱。保护柱一般是填有相似固定相的短柱。保护柱可以经常更换。经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除柱内残留的杂质。在进行清洗时，流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡，每种流动相的体积应是柱体积的20倍左右，即常规分析需要50-75ml。,保存色谱柱时，应将柱内充满乙腈或甲醇，柱接头要拧紧，防止溶剂挥发干燥。绝对禁止将缓冲溶液留在柱内静置过夜或更长时间。色谱柱使用过程中，如果压力升高，一种可能是烧结滤片被堵塞，这时应更换滤片或将其取出进行清洗；另一种可能是大分子进入柱内，使柱头被污染；如果柱效降低或色谱峰变形，则可能柱头出现塌陷，死体积增大。,正相色谱和反相色谱,正相分配色谱用极性物质作固定相，非极
9、性溶剂（如苯、正己烷等）作流动相。反相分配色谱用非极性物质作固定相，极性溶剂（如水、甲醇、己腈等）作流动相。一般地，正相色谱是固定液的极性大于流动相的极性，而反相色谱是固定相的极性小于流动相的极性。正相色谱适宜于分离极性化合物，反相色谱则适宜于分离非极性或弱极性化合物。,4检测系统,常用的检测器：紫外检测器示差折光检测器荧光检测器,（1）紫外检测器,适用于对紫外光（或可见光）有吸收性能样品的检测特点：使用面广（如蛋白质、核酸、氨基酸、核苷酸等）灵敏度高（检测下限为10-10g/m1）线性范围宽 对温度和流速变化不敏感 可检测梯度溶液洗脱的样品,（2）示差折光检测器,凡具有与流动相折光率不同的样
10、品组分，均可使用示差折光检测器检测。适用：糖类化合物优点：通用性强、操作简单缺点：灵敏度低（检测下限为10-7g/m1）流动相的变化会引起折光率的变化不适用于痕量分析和梯度洗脱样品的检测,（3）荧光检测器,凡具有荧光的物质，在一定条件下，其发射光的荧光强度与物质的浓度成正比。适用：具有荧光的有机化合物（如多环芳烃、氨基酸、胺类、维生素和某些蛋白质等）的测定。优点：灵敏度很高（检测下限为10-14 10-12g/m1），用于痕量分析和梯度洗脱样品。,5.数据处理系统,对测试数据进行采集、贮存、显示、打印和处理等操作，使样品的分离、制备或鉴定工作能正确开展。,HPLC易出现的问题,（一）涡流扩散（
11、Eddy diffusion）如果柱装填得不均匀，流动相的速度不均一，就使区带变宽。因此，固定相颗粒要小而均匀，装柱要松紧均一，柱效率高。（二）分子扩散（Molecular diffusion）要减少分子扩散就要采用小而均匀的固定相颗粒装柱。如果流速太慢，被分离物质停留时间长，则扩散严重。,（三）质量转移（Mass transfer）溶质分子在固定相上被吸附和解吸附均需要一定的时间。当流速快时，转移速度慢，来不及达到平衡，流动相就向前移，非平衡移动，使区带变宽。（四）流动相的流速当流速太低时，分子扩散严重。（五）固定相颗粒大小固定相颗粒越小柱效率越高，对流动相流动的阻力越大，需要加大压力才能使它流动。,
