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1、结核分枝杆菌肝素结合血凝黏附素（Heparinbinding haemagglutinin adhesin，HBHA），是由结核分枝杆菌表面表达和分泌的一种糖蛋白，可同时出现在菌体和培养液中。,HBHA可由结核分枝杆菌复合群所有成员分泌，如BCG，及致病性分支杆菌属，麻风分支杆菌（Mycobacterium leprae）、鸟分支杆菌（Mycobacterium avium）,而非致病的耻垢分支杆菌（Mycobacterium smegmatis）则不能分泌。,HBHA研究进展,蛋白类别：细胞壁及细胞进程,相对分子质量 28 kDa,1 蓝色：N端,2 红色：-螺旋区,3.绿色：linker,
2、4.橙色：肝素结合区（C端）,HBHA分为4个结构区,HBHA含有三个功能域：,N端的跨膜结构域：由18个氨基酸残基构成,-螺旋区：由81个氨基酸构成的卷曲螺旋型,C-末端结构域：翻译后进行甲基化修饰，富含赖氨酸-脯氨酸-丙氨酸,N端跨膜结构域可以插入表面膜内，将HBHA蛋白固定于细菌外表面的脂膜上，并能够触发HBHA的折叠及二聚体形成。,-螺旋区可能介导菌体间以及菌体与宿主组织的聚集，从而增强毒力,C末端结构域中含有硫酸糖复合物相互作用的位点，可介导与硫酸化多糖受体的结合，HBHA蛋白质的纯化正是依靠其与肝素的结合力。此末端功能区与人体非吞噬细胞（如上皮细胞等）上含硫酸乙酰肝素的受体结合，从
3、而介导肺结核和肺外结核的发生。,nHBHA合成期间，大部分重复区域的赖氨酸经过氨基转移酶的催化作用形成单甲基或二甲基。另一个参与细胞粘连的分枝杆菌粘附素，即层粘连蛋白（LBP）也存在相似的甲基化修饰。而大肠杆菌（Escherichia coli）表达的HBHA则没有甲基化结构。,耻垢分支杆菌和结核分枝杆菌的细胞裂解液均能使大肠杆菌表达的无甲基化的HBHA实现甲基化，由此可见耻垢分支杆菌虽然缺乏HBHA基因，但仍然含有能使HBHA甲基化的氨基转移酶。,耻垢分支杆菌只能产生层粘连蛋白（LBP）参与细胞粘连，缺乏HBHA基因。,此外，重组耻垢分枝杆菌中表达的 HBHA同样可以形成甲基化结构。,黑色表
4、示N端的结构域,灰色表示-螺旋区,灰白色表示肝素结合区（C端）,斜线表示启动子序列,Delogu G,Bua A,Pusceddu C,et al.Expression and purification of recombinant methylated HBHA in Mycobacterium smegmatisJ.FEMS Microbiol Lett,2004,239(1):33-39.,pMV206载体,MAbE4：能够识别HBHA,MabD2：只能识别有甲基化结构的HBHA,层粘连蛋白（LBP）有存在与HBHA相似的甲基化修饰故能够被MAbE4 与MabD2识别。,只有HBHA全基
5、因序列时才能表达甲基化的HBHA,Lane 2 当HBHA表达时，LBP表达量下降Lane7 当HBHA表达时，LBP表达量变化不大Lane2和Lane7的区别是hbhA基因的上游启动子 可能是同一种机制调节HBHA和LBP表达,MAbE4,MabD2,黑色表示N端的结构域,灰色表示-螺旋区,灰白色表示肝素结合区（C端）,斜线表示启动子序列,MAbE4,MabD2,考马斯亮蓝染色,nHBHA、MS-HBHA、rHBHA,nHBHA、MS-HBHA、rHBHA,nHBHA、MS-HBHA、rHBHA,Delogu等人用构建的在耻垢分支杆菌中表达的带有HIS标签的融合HBHA蛋白，并得到了大量的纯
6、化蛋白，质谱分析结果显示耻垢分支杆菌中表达的HBHA有16个甲基化结构，且甲基化结构与天然HBHA甲基化结构相似，并且证实了该HBHA可用于区分RD1区反应者中活跃性和非活跃性结核病人。,阳性,检测者,IGRA,QFT-IT,MS-HBHA,IFN-分泌,潜伏感染者,1.介导肺结核和肺外结核的发生,通过基因敲除技术发现，HBHA 基因阻断的菌株，显著影响 MTB与上皮细胞之间的作用，但并不影响与巨噬细胞之间的相互作用，用HBHA基因阻断的菌株经鼻感染小鼠，发现其在脾脏的增殖严重受影响，但不影响在肺部的增殖。用抗HBHA抗体包被的野生分枝杆菌经鼻感染后其播散也受损。,以上实验表明，HBHA对 M
7、TB的肺外播散是必要的，与非吞噬细胞之间的相互作用，在肺外结核的发病机制上起重要作用,HBHA主要生物学功能,2.参与实现MTB逃逸吞噬体进入细胞质,天然HBHA可以结合G肌动蛋白，有调节肌动蛋白的作用，但是除去甲基化结构的碳末端功能区后，则不能结合G肌动蛋白。HBHA位于细菌表面，通过控制肌动蛋白的聚合和解聚来调节细胞骨架的动态过程，实现MTB逃逸吞噬体进入细胞质中生存和繁殖。,Esposito C,Marasco D,Delogu G,et al.Heparin-binding hemagglutinin HBHA from Mycobacterium tuberculosis affec
8、ts actin polymerisationJ.Biochem Biophys Res Commun,2011,410(2):339-344,3.可以引起巨噬细胞凋亡,巨噬细胞内线粒体是HBHA的作用靶点，重组耻垢分支杆菌表达的HBHA能够Bax（一种Bcl-2家族的前凋亡蛋白）迁移到线粒体，引起线粒体损伤产生氧化应激，导致巨噬细胞的凋亡。,Sohn H,Kim J S,Shin S J,et al.Targeting of Mycobacterium tuberculosis Heparin-Binding Hemagglutinin to Mitochondria in Macropha
9、gesJ.PLoS Pathog,2011,7(12):e1002435.,4.免疫保护作用,在结核分支杆菌感染中，HBHA可以通过激活NF-B 及PI3-K/Akt-p38-ERK1/2 MAPK等信号通路诱发炎性反应，抵抗结核病的发展。,研究发现82%的活动性结核病患者可检测到抗 HBHA抗体，而潜伏感染者的HBHA抗体阳性率为36%(P0.01),外周血淋巴细胞在体外受到nHBHA刺激时，81.8%的潜伏感染者外周血T细胞可以产生的IFN-高于0.1 ng/ml，而只有17.3%的结核病人外周血T细胞可以产生的IFN-高于0.1 ng/ml，无结核菌感染的健康者产生的IFN-不会高于0.
10、1 ng/ml。,用HBHA作为诊断抗原，同时比较了HBHA、PPD、ESAT-6对结核分支杆菌潜伏感染者的区分效果。在诊断潜伏感染者上HBHA、PPD、ESAT-6的敏感性分别为92.06%、90.00%、40.47%及特异性分别为93.88%、70.00%、90.91%，由此可见HBHA在区分潜伏感染者中显示了较高的敏感性和特异性，并且检测结果不受接种 BCG的影响,潜伏感染者未发病的原因，可能与 HBHA的免疫保护作用关。,耻垢分支杆菌表达的HBHA蛋白作用抗原蛋白，可导致结核病人的外周血中产生高TNF-表达、低IFN-表达的特异性的外周血T细胞反应，而结核病潜伏感染者则产生低TNF-表
11、达、高IFN-表达的特异性的外周血T细胞反应,Molicotti P,Bua A,Cubeddu M,et al.Tuberculosis patients are characterized by a low-IFN-gamma/high-TNF-alpha response to methylated HBHA produced in M.smegmatisJ.Diagn Microbiol Infect Dis,2011,71(4):449-452.,5.很好的抗结核疫苗的候选者,天然HBHA可以有效抵抗结核分枝杆菌的感染，用天然HBHA免疫小鼠后，不但能诱导小鼠产生高水平IFN-，并且
12、能够有效减少感染小鼠的肺脏、脾脏的器官荷菌量及病理损伤，其产生的免疫效果甚至能够达到BCG的水平。,单纯用rHBHA以及耻垢分支杆菌表达的HBHA不能提高小鼠抵抗气溶胶形式的MTB感染的保护力。,通过皮下免疫的方式，5g/只 的剂量将nHBHA,(DDA 和 MPL为佐剂）免疫3次间隔2周。,通过皮下免疫的方式，5g/只 的剂量将rHBHA,(DDA 和 MPL为佐剂）免疫3次间隔2周。,通过皮下免疫的方式，5 105CFU的BCG,静脉注射 105 CFU的MTB,气溶胶感染 200 CFU的MTB,6周后检测保护力,4周后检测保护力,Temmerman S,Pethe K,Parra M,
13、et al.Methylation-dependent T cell immunity to Mycobacterium tuberculosis heparin-binding hemagglutininJ.Nat Med,2004,10(9):935-941.,脾脏,肺脏,BALB/c小鼠静脉注射 105 CFU的MTB 6 周后,C57Bl/6小鼠气溶胶感染 200 CFU的MTB 4 周后,Temmerman S,Pethe K,Parra M,et al.Methylation-dependent T cell immunity to Mycobacterium tuberculos
14、is heparin-binding hemagglutininJ.Nat Med,2004,10(9):935-941.,采用BCG初次免疫,nHBHA加强免疫,提高BCG的免疫保护力,rHBHA加强免疫,提高BCG的免疫保护力,HBHA由BCG中纯化所得,Guerrero G G,Locht C.Boosting with mycobacterial heparin-binding haemagglutinin enhances protection of Mycobacterium bovis BCG-vaccinated newborn mice against M.tuberculo
15、sis.Vaccine.2010 Jun 17;28(27):4340-7,BCG初次免疫BALB/c小鼠,HBHA皮下注射,MTB鼻腔接种,MTB气溶胶感染,HBHA鼻腔接种,MTB鼻腔接种,HBHA最后一次免疫2周后肺脏和脾脏细胞培养液中细胞因子水平,a为HBHA通过皮下注射免疫,b为HBHA通过鼻腔接种免疫,HBHA通过皮下注射和鼻内接种加强免疫，均能提高BCG对MTB鼻腔接种感染保护力的作用,HBHA单独通过皮下注射和鼻内接种免疫其保护作用不明显。,HBHA不同的接种方式是否影响保护力,BCG初次免疫BALB/c小鼠,HBHA皮下注射,MTB鼻腔接种,HBHA鼻腔接种,b为鼻腔接攻毒,
16、c为气溶胶攻毒,HBHA通过皮下注射加强免疫,HBHA加强免疫对MTB鼻腔接种感染和气溶胶感染都用提高BCG保护力的作用,MTB不同的感染方式接种方式是否影响HBHA提高保护力,BCG初次免疫BALB/c小鼠,HBHA皮下注射,MTB气溶胶感染,MTB鼻腔接种,BCG初次免疫BALB/c小鼠,rHBHA皮下注射加强免疫3次,鼻腔接种,气溶胶感染,脾脏细菌荷菌量显著低于单纯BCG免疫组,肺脏细菌荷菌量并无变化,肺脏细菌荷菌量显著低于单纯BCG免疫组,脾脏细菌荷菌量显著低于单纯BCG免疫组,Guerrero G G,Locht C.Recombinant HBHA boosting effect on BCG-induced immunity against Mycobacterium tuberculosis infectionJ.Clin Dev Immunol,2011:730702.,因此经通过鼻腔接种的感染，HBHA的甲基化结构对于提高BCG的保护作用并非必需，但是对于气溶胶感染途径，HBHA的甲基化结构则必不可少。由此可见HBHA同样是很有前景的异源免疫策略的候选者。,谢谢大家！,
