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1、Sanger法测序-在HLA-SBT分型中应用,2009.10,杨华志 唐金凤 胡志锋 周巧云 杨晓琴,目录,HLA的介绍测序原理Sanger法测序测序反应操作流程及注意事项简单的峰图分析,HLA的介绍,为什么要进行HLA检测,HLA 是迄今为止发现的多态性最高的基因系统之一，它与同种异体器官移植的排斥反应密切相关，而且该基因的高度多态性在法医学上的亲子鉴定、个人识别以及疾病相关性和人类进化研究方面也起着重要作用。HLA配型在器官移植中是必要的。HLA的相容性程度（配型的符合程度）是决定移植物长期存活的主要因素之一。,HLA的介绍,HLA分型,1、血清学分型2、细胞学分型3、DNA分型 PCR
2、-RFLP技术 PCR-SSO技术 PCR-SSP技术 PCR-SBT技术,HLA的介绍,PCR-SBT:以PCR扩增所要分析的基因片断，然后对DNA序列进行分析，可以直接得到基因型。分辨率高，可大规模进行，精确度高，能直接发现新的等位基因。SBT法HLA高分辨分型已逐步在欧美国家推广，并成为“金标准”。目前我们华大也以SBT法为主，并结合SSP方法进行HLA的配型。,HLA的介绍,PCR-SBT法分型的基本流程,HLA的介绍,back,测序原理,双脱氧链终止法（Sanger法）：,1977年，英国人Fred Sanger 发现，如果在DNA复制过程中掺入ddNTP，就会产生一系列末端终止的D
3、NA链，并能通过电泳按长度分辨。不同末端终止DNA链的长度是由掺入到新合成链上随机位置的ddNTP决定的。,脱氧核糖核苷酸通过形成3,5-磷酸二酯键延长DNA链,测序原理,测序原理,测序原理,经PCR扩增反应，可以得到一系列长度不同的产物，由于ddNTP带有荧光标记，对产物进行电泳分离，并用相应的仪器进行检测，就可以读出模板的序列。,PCR与测序反应的比较,PCR 测序反应DNA 聚合酶 Taq酶 测序酶引物 一对 单向底物 dNTP dNTP+ddNTP*模板 量少 质量要求高产物 等长的DNA片段 长短不一的片段 3端带荧光标记,测序原理,back,测序反应操作步骤,实验前准备Mix配制测
4、序引物稀释编板号（日期_S位点_测序引物_纯化板编号_（其它）反应加样短暂离心后上PCR仪,预约PCR仪编写测序反应表根据要检测的样品数计算试剂的需要量查看实验所需的耗材是否够用用70乙醇擦桌面，不能残留粉尘,测序反应实验前准备,back,Mix配制,Step1：按实验需要的体系和用量计算各组分的加量，冰上或4避光缓慢解冻2.5BigDye；计算公式：1（V）2.5（VBD）5（VBuffer）其中V反应体系体积，通常5l；VBD2.5BigDye 体积；VBuffer5Buffer体积,Step2：振荡3秒或颠倒5次混匀，离心10秒，冰上或4避光保存，当天使用；剩余mix可-20保存，避免反
5、复冻融，解冻2次内用完。,常用配方：,Mix配制注意事项,对多个使用相同引物的测序反应可以把引物加到mix中 配制mix和稀释引物的millipore水应分别使用；吸取不同的试剂要换枪头；试剂打开后应立即吸取并盖好盖子，接触样品的容器、试剂严禁长时间暴露在空气中，时刻防止污染！,back,引物稀释,干粉稀释Step1：按合成报告单上的分装规格计算稀释至所需浓度应加入的超纯水；Step2：将干粉离心12000rpm，2min；Step3：加入一定体积的millipore水后盖好离心管盖；Step4：振荡1分钟，室温放置30分钟，使其充分溶解；Step5：再次振荡30秒，离心10秒。,引物稀释,液
6、体稀释：根据以下公式计算（通常使用液浓度3.2pmol/L）加水量=(储存液体积储存液浓度/使用液浓度)-储存液体积 按预算的体积在1.5mL离心管中加入millipore水，吸取所需体积的指定引物储存液加入水中，充分振荡30秒，离心10秒，备用。,稀释引物注意事项,1、引物稀释前要离心，液体引物12000rpm离 心30s,干粉引物12000rpm离心2min。2、打开干粉引物离心管盖时动作尽量轻缓，打开的角度不超过45。3、每次稀释引物前，均需用新的millipore水。4、加水稀释时注意枪头的更换，避免交叉污染。5、稀释完后，将引物的流水号和引物名称一一对应写在新的Ep管上。,back,
7、反应加样,按测序反应表将待测样本和测序引物摆放到96试管架上对应位置；移液器调至所需量程；实验用品放在便于操作的位置；测序反应板标记板号后开始加样。按照反应体系加样：,每次加完后都要离心一下，检查每个孔是 否都已加入，然后才 进行下一步,A、B位点用1/27体系 DR位点用1/20体系 1/27体系：1/20体系：模板 1.0 L 模板 1.0 LBigdye（2.5）0.3L Bigdye（2.5）0.4L5buffer 0.85 L 5buffer 0.8LPrimer（3.2p）1.0 L Primer（3.2p）1.0 L 去离子水 1.85 L 去离子水 1.8L-5L 5L,加样时
8、注意事项：,1.使用前检查移液器量程设定是否准确；2.使用时检查吸取液体量是否准确，排液后枪头内不能有残留；3.在距管口3-5毫米处贴管壁加微量试剂.,加样时注意事项：,4.加样使用的枪头在枪头盒中的位置对应测序反应板每个孔的位置；每加完一种试剂后都要在黑色背景上检查，有少加或漏加情况时应立即补足，确认无误后方可进行下一步操作；5.加错试剂时立即在测序反应表中记录，在新的板孔中重新加样；6.加不同试剂或相同试剂加入含有不同试剂的板孔 中，必需换枪头；,back,上PCR仪：,1.短暂离心后上PCR仪。2.测序反应程序：96，2min96，10s55，5s60，2min25cycles15，；,
9、3.PCR仪程序运行结束后冷却到15，退出程序，取下测序反应板，记录PCR仪运行情况；在纯化板左边画上“”代表已上PCR仪；冰箱冷藏区特定位置保存，待纯化，并通知纯化岗同事。,上PCR仪注意事项：,1.上机前确认样品板的孔都加了样品；2.确认PCR程序是否正常终止；3.程序结束后，观察每孔是否有蒸干现象；4.连续使用PCR仪时，两轮之间让机器待机20分钟以上。,back,测序检测所用的3730XL,测序峰图的简单分析,我们所用的峰图分析软件为：Sequence Scanner V 1.0,整板峰图的大概情况：,原始数据Raw窗口：,原因：1、模板质量差；2、模板浓度过高或者过低；3、纯化时样
10、品丢失；4、引物降解或者加错；5、Bigdye浓度过低或者失效；6、水污染；7、PCR仪温度不稳定,解决方案：1、检测模板纯度；2、调节模板浓度；3、换新的引物；4、提高Bigdye浓度；5、换水；6、检 测PCR仪；7、保证纯化时酒精的浓 度及体积，倒甩时速度不能高于 185g,无反应,测序引物问题：,现象：每个峰后面有个同样荧光信号的小“尾巴”。原因：合成是引物多一个碱基。对策：重新合成引物。,现象：每个峰前面有个同样荧光信号的小“尾巴”。原因：合成时引物少一个碱基。对策：重新合成引物。,引物或模板不纯：,现象：整个峰图噪音都比较高；原因：引物或模板不纯；对策：选用高纯度的引物，或模版纯化
11、要充分。,原因：1、模板不纯；2、模板上有两个引物结合位点；3、加入两个引物；4、退火温度 过低；5、纯化时污染,解决方案：1、优化PCR反应条件；2、重新设计引物；3、提 高测序反应的退火温度；4、加 样及纯化时要防止污染,套峰,原因：1、太多的模板量；2、Bigdye稀释过度；3、模板量 过少；4、引物过量；5、模 板纯化不好；6、模板上有不 容易测通的区域（如poly G）,解决方案：1、检测模板浓度及纯度；2、减少反应体积优于提高模 板稀释度；3、检测引物浓度是否 正确；4、检测是否有不易测通的 区域存在。,读长短,原因：1、部分测序反应失败；2、模板量太多或太少；3、测序反应后纯化丢失了部分样品；,测序结果背景高并且信号值低(150),POLY结构对信号的影响：,Poly在序列的前端对信号影响较小,Poly在序列的后端对信号影响较大,Poly-G/poly-C很容易导致信号中断和信号乱：,Thank you!,back,
