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1、第三章 外植体无菌接种 一般来说，无论何种类型的细胞工程技术，起始阶段均涉及外植体取材、灭菌、接种与培养等基本过程。,一、植物材料的培养与取材 外植体是指用于离体培养的活的植物组织、器官等材料，是植物离体培养的基础材料。,1、外植体的来源-生长在自然环境下的植物-有目的地培育在温室控制条件下生长的植物-无菌环境下已经过离体培养的植物 自然环境中生长的植株，一般带有微生物，甚至与某些微生物具有寄生关系，使植株具有内生菌。取自这些植物的外植体，在培养过程中会有微生物滋生，从而影响培养效果。,自然环境生长植株,温室控制条件下生长植株,已离体培养植株,多数情况下，应尽量使用温室或人工气候室控制培养的植
2、物材料作为外植体来源，减少培养过程中的微生物感染概率。同时，生长在控制条件下的植物可以保持培养料间的一致性，提高实验的可重复性，也便于培养技术的规范。,某些多年生植物或特殊材料，必须取自自然生长的植物，就需要尽可能避免使用那些生长过于潮湿和不洁净环境中的植物。对于培养过程中可能出现内生菌污染的材料，应尽量取生长旺盛期的生长点部位作为起始培养的材料。,2、供体植株的管理 取自室外的外植体材料，供体植株的管理十分重要，这与外植体培养时的污染率密切相关。植株管理中应注意：避免昆虫危害 许多昆虫如蚜虫、螨类和飞虱是许多植物病虫害的传播媒介，会引起植物组织的潜在感染。,注意防病 尤其是真菌和细菌病害的侵
3、染，取自感病植株的外植体，在培养中的污染率远远高于来自健康植株的外植体，必要时需使用化学药剂防治病害。控制湿度 给供体植株浇水时应从根部给水，避免从上部浇水，以免上部形成易于病原侵染的湿度环境；尽可能降低温室湿度；取材前尽可能保持植株干爽。,1、材料取材 材料选择 培养材料应选择有代表性的主要植物、选择性状优良的种质或特殊的基因型。快速繁殖时应在植株生长的最适时期取材，花药培养应在花粉发育到单核期取材。,cm之间。胚胎培养或脱毒在0.5cm以下。材料太大易污染，材料太小难于成活。采收 从生长健壮的无病虫害的植株上选取发育正常的器官和组织。最好采用茎尖，后代性状较稳定，携带细菌较少。,二、预处理
4、与表面灭菌 1、预处理 先对植物材料进行修剪整理，去掉不需要部分，将准备使用的植物材料（外植体）在流水中冲洗20-60分钟，备用。如特别不洁的外植体，可先用加有洗涤剂的水清洗10-15分钟，再用流水冲洗干净。,2、表面灭菌（1）操作人员穿戴灭菌过的工作服、口罩。进入接种室前双手用洗涤剂清洗干净，操作前再用70%酒精或消毒剂擦洗双手。（2）操作期间双手和台面常用70%酒精或消毒剂擦拭。超净工作台使用前必须用紫外灯照射杀菌，然后开启风机。,（3）接种用工具（解剖刀、剪刀、镊子）可放入70-75%酒精中，使用时需火焰灼烧灭菌，冷却后使用。（4）外植体放入超净工作台内，置70-75%酒精中5-60 秒
5、，0.1氯化汞6-10分钟，或10%的漂白粉上清液中10-15分钟，然后用无菌水冲洗3-5次。灭菌时需进行搅动。,表面灭菌剂种类较多，可选取1-2种使用。常用灭菌剂使用浓度及效果比较表灭菌剂 使用浓度 持续时间 去除的难易 效果次氯酸钙 9-10 5-30分钟 易 很好次氯酸钠 2 5-30分钟 易 很好氯化汞 0.1-1 5-10分钟 较难 最好抗菌素 4-50mgL 30-60分钟 中 较好酒精 70-75%0.2-2分钟 易 好过氧化氢 10-12%5-15分钟 最易 好,三、外植体的接种无菌接种 外植体的接种是把经过表面灭菌后的植物材料切碎或分离出器官、组织、细胞、转放到无菌培养基上的
6、全部操作过程。整个过程均需无菌操作。（1）借助接种用工具将材料切割分离。,（2）将培养基放入超净工作台内，火焰灼烧培养基瓶口，然后打开培养瓶口，置培养瓶为斜角，避免灰尘落入平中。（3）迅速将切割分离下的所需组织、细胞、器官，放入培养基上，及时盖上瓶盖。（4）工具用后应及时灭菌，避免交叉污染。（5）工作人员操作时禁止不必要的谈话。,接种时在近火焰处打开瓶口，使瓶倾斜，以免空气中微生物落入瓶中,正 确 错 误,整个接种操作应在近火焰处进行，且动作要迅速,正 确 错 误,接种过程中尽可能达到悬空要求,防止操作带来的污染,正 确 错 误,接种时不得用手接触瓶盖内壁或瓶口,正 确 错 误,瓶盖朝上放，接
7、种完毕后立即盖好瓶口,正 确 错 误,接种完一瓶用火烧用具以防止交叉污染产生,种子和分生组织：培养时通常将其贴放在培养基表面，而不是插到培养基内部，以免供氧不足,正 确 错 误,接种茎段：注意形态学下端插入培养基内，而形态学上端露于空气中,正 确 错 误,第五节 外植体的培养 接种只是完成了离体培养的第一步，植物离体培养和栽培植物一样，生长过程中也受到各种环境因素的影响。培养条件是离体培养能否成功的关键。在培养基条件适宜的基础上，影响试管苗生长的主要因素有光照、温度、湿度、氧气。,一、外植体的培养条件1、光照 光照对植物生长发育有重要作用，是离体培养中非常重要的环境因素。光照强度、光质以及光照
8、时间，对细胞的增殖、器官的分化都有很大影响。除特殊要求外，一般都采用日光灯作光源，光照强度1000-5000Lx，根据不同植物或器官需要，可以每天连续光照12-16小时，也可每天光照16小时，8小时黑暗。,2、温度 离体培养中对温度的控制比光照更为重要，大所数植物最适温度在23-32之间。培养室温度是252。低于15时，培养的组织生长停顿，高于35对生长也不利。因此，培养室应安装空调机或其他的控温设备。,3、湿度 培养瓶内相对湿度通常是100%，而环境中的相对湿度会直接影响培养基的水分蒸发。因此，培养过程中，培养室一般要求相对湿度保持在70-80%，相对湿度过低影响培养物生长和分化，应向室内喷
9、洒水，以提高湿度；过高杂菌滋生，大量污染，应及时地通风除湿。,4、氧气 离体培养的试管苗是需要氧气的，在固体培养或液体静置培养时，如果组织完全浸入培养基中，与氧气隔绝，就会停止生长。因此，接种时要有部分组织合空气接触。振荡培养是解决通气的良好办法。固体培养中，如瓶塞不透气，培养物也不能生长，要选择通气性好的培养瓶盖，增加可利用的氧气，迅速除去释放出来的CO2，有利于外植体外层细胞开始分裂。,组织培养步骤图,（1）准备阶段 查阅相关文献，根据已成功培养的相近植物资料，结合实际制定出切实可行的培养方案。根据实验方案配制适当的化学消毒剂以及不同培养阶段所需的培养基，并经高压灭菌或过滤除菌后备用。（2
10、）外植体的选择与消毒 选择合适的部位作为外植体，采回后经过处理，然后进行消毒处理。将消毒后的外植体在无菌条件下切割成一定大小的小块，或剥离出茎尖、挑出花药，接种到启动培养基上。,（3）启动培养 接种后的材料置于培养室或光照培养箱中培养，促使外植体中已分化的细胞脱分化形成愈伤组织，或顶芽、腋芽直接萌发形成芽。将愈伤组织转移到分化培养基分化成不同的器官原基或形成胚状体，最后发育形成再生植株。（4）增殖培养 分化形成的芽、原球茎数量有限，采用适当的增殖培养基经反复多次切割转接。当芽苗繁殖到一定数量后，再将一部分用于壮苗生根，另一部分保存或继续扩繁。进行脱毒苗培养的还要进行病毒检测。,（5）生根培养
11、刚形成的芽苗往往比较弱小，多数无根，此时可降低或不加细胞分裂素浓度，提高生长素浓度，促进芽苗生根，提高其健壮度。（6）炼苗移栽 选择生长健壮，有35条根的生根苗进行炼苗，移栽到疏松透气的基质中，注意保温、保湿、遮荫。当苗完全成活后，再移向大田。,拟定培养方案,外植体预处理,外植体无菌接种,启动培养,分化出芽、胚状体或原球茎,继代增殖培养,生根培养,炼苗移栽,成活供生产使用,植物组织培养的一般程序,培养基配制灭菌,二、外植体的成苗途径（第三章后讲）外植体的成苗途径有三种：（一）外植体-愈伤组织-完整植株。具体又可分为三种：1、愈伤组织-同时长芽和根-植株。2、愈伤组织-茎-根-植株。3、愈伤组织
12、-根-芽-植株。,（二）外植体-胚状体-植株。可从以下几种培养物中产生：1、器官上发生。2、愈伤组织上发生。3、游离单细胞发生。4、小孢子发生。诱导胚状体比诱导芽数量多、速度快、结构完整。（三）外植体-直接形成根与芽-植株。如茎尖培养,三、培养中常见问题（一）污染的原因及其预防措施1、污染原因 污染是指在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。病原菌：细菌及真菌两大类。,细菌污染特点-菌斑呈黏液状，接种后1-2天发现。污染途径：外植体带菌 培养基及器皿灭菌不彻底 操作人员未遵守操作规程 真菌污染的特点-污染部分长有不同颜色的霉菌，接种后3-10天发现。污染途径：周围环境不清
13、洁 超净工作台过滤装置失效 培养瓶的口径过大,2、污染的预防措施防止材料带菌的措施-茎尖作外植体时，进行预培养（无糖）或暗培养。无糖营养液或自来水使枝条抽枝，以新抽嫩枝作外植体。-晴天取材，下午取材，经日晒过可杀死部分细菌或真菌。-接种时除去外部韧皮组织，只接内部的分生组织。,（2）外植体的灭菌-多次灭菌法，次氯酸钠-无菌水-次氯酸钠-多种药液交替浸泡法，肥皂水-酒精-次氯酸钠-无菌水。,器皿与金属器械的灭菌 玻璃器皿可采用湿热灭菌或干热灭菌 金属器皿一般火焰灭菌，也可干热灭菌布质制品的灭菌 湿热灭菌无菌操作室的灭菌 2%新捷尔灭或70%酒精擦拭（喷雾），紫外灯照射，定期甲醛和高锰酸钾熏蒸。严
14、格按照操作程序。,（二）外植体的褐变及其防止措施。1、褐变的原因 褐变是指外植体在培养过程中体内的多酚氧化酶被激活，使细胞内的酚类物质氧化成棕褐色的醌类物质，这种致死的褐变物向外扩散致使培养基逐渐变成褐色，抑制其它酶的活性，影响外植体的分化，最后变褐死亡的现象。,基因型 某些植物酚类物质含量较多。外植体的生理状态 幼年的材料培养含醌类物质较少。培养基的成分-过高的无机盐浓度-生长调节物质使用不当，BA过多-分生能力强的材料，氧化受抑制，褐变也被抑制-培养条件不适宜，温度过高或光照过强，褐变加速。材料转移时间 时间过长引起材料褐变。,2、褐变的防止措施选择适宜的外植体及最佳培养基。连续转移。加抗
15、氧化物。加活性炭。0.1-0.5%活性炭,（三）玻璃化现象及其预防措施1、玻璃化现象及其产生原因玻璃化是在细胞生长过程中的环境产生变化，试管苗为了适应变化了的环境而呈玻璃状。主要原因是：激素浓度 BA浓度提高，导致玻璃化苗的产生。琼脂浓度 琼脂浓度低，玻璃化苗增加。,温度 低温易形成玻璃化苗。光照时间 一般要求10-12h，大于15h玻璃苗增加。通风条件 培养瓶容量小，气体交换不良，玻璃化苗多。离子水平 植物种类不同，离子形态比例量要求不同。,2、预防措施控制无机营养成分，降低氮（铵态氮）和氯。提高蔗糖和琼脂浓度降低细胞分裂素和赤霉素浓度，增加生长素比例。增加自然光照1000-1800lx，控
16、制光照时间8-12h。适温生长，热击处理防止玻璃化发生。使用透气性好的封口膜。培养基中加入间苯三酚、根皮苷或多效唑、矮壮素。,第五节 试管苗的驯化移栽（后讲）一、试管苗的特点1、试管苗的生态环境 组织培养出来的苗通称试管苗或组培苗。试管苗长期生活在密闭容器中，形成其独特生态系统，与外界环境相比，有四大差异,高恒温 试管苗整个生长过程中采用的是恒温培养，温差很小。并且温度一般控制在25+2甚至更高。外界环境条件温度不断变化，其调节由太阳辐射决定，温差很大，而且一般不会达到25+2。,高湿试管瓶内水分移动途径有两条：试管苗水分从气孔蒸腾 培养基向外蒸发，凝结后又进入培养基 水分移动循环造成瓶内相对
17、湿度接近100%，远远大于瓶外空气湿度，故试管苗蒸腾小。,弱光 试管瓶内光照一般比太阳光弱，幼苗生长也较弱，不能受太阳光直接照射。无菌 试管苗所在环境无菌，与外界有菌环境不同，试管苗也无菌，同时，培养瓶内气体环境较为特殊，与外界环境有很大差异。,2、试管苗特点试管苗生长细弱、茎叶表面角质层不发达叶绿体的光合作用较差叶片气孔数目少，活性差根的吸收功能差对逆境的适应性和抵抗能力较差,二、试管苗的驯化1、驯化的目的 提高试管苗对外界环境条件的适应性，提高光合能力，使试管苗健壮，提高试管苗移栽成活率。2、驯化原则 调节温湿光和无菌等环境要素，开始和培养条件相似，后期与预计栽培条件相似。,3、驯化方法
18、将长有完整试管苗的培养瓶由培养室转到半遮荫的自然光下锻炼，并打开瓶盖注入少量自来水使幼苗逐渐降低温度，转向有菌，一般进行1-2周。,三、试管苗的移栽1、常规移栽法 将已诱导出大量根的试管苗，驯化3-5天，移到无菌混合土中，当长出2-3片新叶时，栽到田间或盆钵中。2、直接移栽法 直接将试管苗移栽到盆钵的方法。,3、嫁接移栽法 用试管苗做接穗嫁接在同一植物的实生苗上。嫁接移栽优点：1、移栽成活率高。2、适用范围广，嫁接移栽也适用于弱苗或污染苗。3、需时间短，20天成活，缓苗期10-15天。4、植株生长发育较快。,四、提高试管苗移栽成活率的途径1、壮苗移栽比弱苗移栽成活率高2、生长素（NAA）利于生根3、低无机盐浓度生根效果好4、活性炭利于嫩茎生根5、避免太阳直射，温度25-30，湿度在85%以上6、使试管苗逐渐从无菌向有菌过渡,思考题：1、分别写出MS、N6、White培养基特点。2、写出培养基高压灭菌操作程序。3、简述植物离体培养的无菌操作程序。4、玻璃化现象的原因及其预防措施。5、试分析外植体培养中污染的防治措施。6、说明试管苗驯化原则、目的和方法。7、简述提高试管苗移栽成活率途径。,
