《嫌气发酵机制》PPT课件.ppt

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1、发酵机制：微生物通过其代谢活动，利用基质（底物）合成人们所需要的代谢产物的内在规律。代谢控制发酵：是指利用生物的、物理的、化学的方法，人为的改变了微生物的生长代谢途径，使之合成、积累、分泌我们所需要的产品的过程。发酵机制研究的内容：1.微生物的生理代谢规律（就是各种代谢产物合成途径及代谢调节机制）；2.环境因素（营养条件、培养条件等）对代谢的影响及改变代谢的措施；,第三章 嫌气发酵机制,第一节 微生物细胞调节机制,酶的调节：酶合成的调节 酶活性的调节细胞膜渗透性调控能荷调节,微生物细胞的代谢调节方式很多，例如可调节营养物质透过细胞膜而进入细胞的能力，通过酶的定位以限制它与相应底物的接近，以及调

2、节代谢流等。其中以调节代谢流的方式最为重要，它包括两个方面，一是“粗调”，即调节酶的合成量，二是“细调”，即调节现成酶分子的催化活力，两者往往密切配合和协调，以达到最佳调节效果。,一、酶的调节,（一）酶活性的调节,酶活性的调节：酶分子水平上的一种代谢调节，通过改变现成的酶分子活性来调节新陈代谢的速率，包括酶活性的激活和抑制两个方面。酶活性的激活：在分解代谢途径中，后面的反应可被较前面的中间产物所促进。酶活性的抑制：主要是反馈抑制，表现在某代谢途径的终产物过量时，该产物可反过来直接抑制该途径中第一个酶的活性，促使整个反应过程减慢或停止，从而避免了末端产物的过多累积。,1、反馈抑制的类型：（1）直

3、线式代谢途径中的反馈抑制：这是一种最简单的反馈抑制类型。由于终产物合成过多，使得途径中第一个酶的活性受到抑制，因而一系列中间代谢产物无法合成，最终导致终产物的合成完全停止。,（2）分支代谢途径中的反馈抑制：1）同功酶调节：同功酶：指催化相同的生化反应，但酶蛋白分子结构有差异的一类酶。同功酶调节:在一个分支代谢途径中，如果分支点以前的一个较早的反应是由几个同功酶所催化，则分支代谢的几个最终产物往往分别对这几个同功酶发生抑制作用。,例：大肠杆菌天冬氨酸族氨基酸的合成。有三个天冬氨酸激酶同功酶催化途径的第一个反应，分别受赖氨酸，苏氨酸，甲硫氨酸的调节,大肠杆菌以天门冬氨酸为前体合成苏氨酸(Thr)、

4、异亮氨酸(Ileu)、甲硫氨酸(Met)和赖氨酸(Lys)的代谢途径中有三种天门冬氨酸激酶的同功酶(AKI、AKII和AKIII)和两种高丝氨酸脱氢酶的同功酶(HSDHI和HSDHII)。其中AKI和HSDHI受到苏氨酸、异亮氨酸的反馈抑制和阻遏，AKII和HSDHII受甲硫氨酸的反馈抑制和阻遏；AKIII受赖氨酸的反馈抑制和阻遏。,2）协同反馈抑制：指分支代谢途径中的几个末端产物同时过量时才能抑制共同途径中的第一个酶的一种反馈调节方式。例如，在多粘芽孢杆菌（Bacillus polymyxa）合成赖氨酸、蛋氨酸和苏氨酸的途径中，终点产物苏氨酸和赖氨酸协同抑制天冬氨酸激酶。,E或G单独一种产物

5、过量并不能引起抑制作用。,3）合作反馈抑制：又称增效反馈抑制，系指两种末端产物同时存在时，可以起各比一种末端产物大得多的反馈抑制作用。,在嘌呤核苷酸合成中，磷酸核糖焦磷酸酶受AMP和GMP（和IMP）的合作反馈抑制，二者共同存在时，可以完全抑制该酶的活性。而二者单独过量时，分别抑制其活性的70%和10%。,4）累积反馈抑制：每一分支途径的末端产物按一定百分率单独抑制共同途径中前面的酶，所以当几种末端产物共同存在时，它们的抑制作用是累积的。在各末端产物的抑制作用互不干扰，之间既无协同效应，亦无拮抗作用。,大肠杆菌谷氨酰胺合成酶(GS)活性的调节是一个典型的累积反馈调节的例子。谷氨酰胺由谷氨酸、铵

6、和ATP合成。谷氨酰胺合成酶对每一种末端产物均有特异的结合部位。当上述8种末端产物同时过量都与酶结合时，谷氨酰胺合成酶的活性将受到最大的抑制。,5）顺序反馈抑制：通过逐步有顺序的方式达到的调节，称为顺序反馈抑制。分支代谢途径中的两个末端产物，不能直接抑制代谢途径中的第一个酶，而是分别抑制分支点后的反应步骤，造成分支点上中间产物的积累，这种高浓度的中间产物再反馈抑制第一个酶的活性。因此，只有当两个末端产物都过量时，才能对途径中的第一个酶起到抑制作用。,枯草芽孢杆菌合成芳香族氨基酸的代谢途径就采取这种方式进行调节。,枯草杆菌在芳香族氨基酸合成中，色氨酸(Try)抑制邻氨基苯甲酸合成酶(AS)，苯丙

7、氨酸(Phe)抑制预苯酸脱水酶(PT)，酪氨酸(Tyr)抑制预苯酸脱氢酶(PD)，预苯酸和分支酸又部分地抑制7-磷酸-2-酮-3-脱氧庚糖酸合成酶(DS)。,PEP：磷酸烯醇丙酮酸；E4P：4-磷酸赤藓糖；DAHP：7-磷酸-2-酮-3-脱氧庚糖酸；CA：分支酸；Per：预苯酸；AA：邻氨基苯甲酸；HPPA：对羟基苯丙酮酸；PPA：苯丙酮酸；Tyr：酪氨酸；Try：色氨酸；Phe：苯丙氨酸；I：7-磷酸-2-酮-3-脱氧庚糖酸合成酶；II：邻氨基苯甲酸合成酶；III：分支酸变位酶；IV：预苯酸脱氢酶；V：预苯酸脱水酶,2、反馈抑制的机制,某些小分子化合物能与酶活性中心之外的部位特异地非共价可逆

8、结合，引起酶蛋白的分子构象发生改变，而改变酶的活性，这种现象称为酶的变构调节,（二）酶合成的调节,酶合成的调节是一种通过调节酶的合成量，进而调节代谢速率的调节机制，这是一种在基因水平上（在原核生物中主要在转录水平上）的代谢调节:是一类较间接而缓慢的调节方式,其优点是通过阻止酶的过量合成节约生物合成的原料和能量。能促进酶生物合成的现象，称为诱导。能阻碍酶生物合成的现象，称为阻遏。,1.酶合成调节的类型,诱导酶：细胞为适应外来底物或其结构类似物而临时合成的一类酶。组成酶：是细胞固有的酶类，其合成是在相应的基因控制下进行的，不因分解底物或其结构类似物的存在而受影响诱导物：是指能促进诱导酶产生的物质。

9、它可以是该酶的底物也可以是难以代谢的底物类似物或是底物的前体物质。,（1）诱导,在微生物的代谢过程中，当代谢途径中某末端产物过量时，除可用前述的反馈抑制的方式来抑制该途径中关键酶的活性以减少末端产物的生成外，还可通过阻遏作用来阻碍代谢途径中包括关键酶在内的一系列酶的生物合成，从而更彻底地控制代谢和减少末端产物的合成。,（2）阻遏,1）末端产物阻遏：指由某代谢途径末端产物的过量累积而引起的阻遏。,2）分解代谢物阻遏：细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮源）存在时，利用快的分解底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利用的碳/氮源本身直接作用的结果，而是通过碳源（

10、或氮源等）在其分解过程中所产生的中间代谢物所引起的阻遏作用。,葡萄糖效应,葡萄糖效应：E.coli培养在含乳糖和葡萄糖的培养基上，可优先利用葡萄糖，并于葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖，这就产生了在两个对数生长期中间隔开一个生长延滞期的“二次生长现象”。这一现象称葡萄糖效应。其原因是，葡萄糖的存在阻遏了分解乳糖酶系的合成。,2、酶合成调节的机制,操纵子模型：在DNA分子的不同区段上至少有四种基因，即调节基因R（编码阻遏物）、操纵基因O（阻遏物结合、控制结构基因）、启动基因P（RNA聚合酶结合位点）和结构基因S（转录mRNA）。操纵基因、启动基因和结构基因又构成了操纵子。,外界物质的吸收或代谢产物的分

11、泌都需经细胞膜的运输，如发生障碍，则胞内合成代谢物不能分泌出来，影响发酵产物收获，或胞外营养物不能进入胞内，也影响产物合成，使产量下降。例：在青霉素发酵中，产生菌细胞膜输入硫化物能力的大小影响青霉素发酵单位的高低。如果输入硫化物能力增加，硫源供应充足，合成青霉素的量就增多。采取生理学或遗传学方法，可以改变细胞膜的透性，解除末端产物反馈抑制作用，使细胞内的代谢产物迅速渗漏到细胞外。通过生理学手段控制细胞膜的渗透性：生物素亚适量、加青霉素通过遗传学细胞膜缺损突变而控制其渗透性：油酸缺陷型、甘油缺陷型,二、控制细胞膜的渗透性,三、能荷调节（磷酸盐调节）,能荷=(ATP+ADP)(ATP+ADP+AM

12、P),能荷（Energy charge）表示细胞中的能量状态。三磷酸腺苷(ATP)是为许多反应提供能量的高能磷酸化物,细胞中的ATP、ADP和AMP含量处于相对平衡的状态细胞中的能量状态。,能荷（EC）可用下式来表示：,系统中只有ATP时，EC值为1；只有AMP时，EC值等于0。,在厌氧条件下，酵母菌无法通过呼吸链产生ATP，细胞能荷较低。,ADP和AMP激活磷酸果糖激酶，使利用葡萄糖生产酒精的速度加快。,四、代谢调控在发酵工业中的应用,利用微生物代谢调控能力的自然缺损或通过人为方法获得突破代谢调控的变异菌株，可为发酵工业提供生产有关代谢产物的高产菌株：,抗反馈调节突变株：就是指一种对反馈抑制

13、不敏感或对阻遏有抗性的组成型菌株，或兼而有之的菌株。在这类菌株中，因其反馈抑制或阻遏已解除，或是反馈抑制和阻遏已同时解除，所以能分泌大量的末端代谢产物。,营养缺陷型突变株：在直线式的合成途径中，营养缺陷型突变株只能累积中间代谢物而不能累积最终代谢物。但在分支代谢途径中，通过解除某种反馈调节，就可以使某一分支途径的末端产物得到累积。,谷氨酸棒杆菌鸟氨酸生物合成途径乙酰谷氨酸合成酶乙酰谷氨酸激酶 NO乙酰谷氨酸醛脱氢酶乙酰鸟氨酸转氨酶NO乙酰谷氨酸O乙酰鸟氨酸乙酰基转移酶鸟氨酸氨甲酰基转移酶精氨琥珀酸合成酶精氨琥珀酸酶,赖氨酸发酵：工业上选育了谷氨酸棒杆菌的高丝氨酸缺陷型菌株作为赖氨酸的发酵菌种。

14、（高丝氨酸脱氢酶）,赖氨酸发酵：在选育了谷氨酸棒杆菌的高丝氨酸缺陷型菌株基础上，选育抗赖氨酸结构类似物突变株和抗苏氨酸结构类似物突变株，解除赖氨酸和苏氨酸的协同反馈抑制。,第二节 糖酵解途径及调节机制,C6H12O6+2ADP+2Pi+2NAD 2CH3COCOOH+2ATP+2NADH2,糖酵解途径是指细胞在细胞质中分解葡萄糖生成丙酮酸的过程，此过程中伴有少量ATP的生成。这一过程是在细胞质中进行，不需要氧气，每一反应步骤基本都由特异的酶催化。,一、糖酵解途径（EMP途径）,1、广泛存在于各种细胞中，每个反应都不需要氧参与。2、分为两个阶段：6C（葡萄糖）3C（3-磷酸甘油醛）：消耗2ATP

15、 3C（3-磷酸甘油醛）丙酮酸：生成4ATP3、糖酵解有10多个反应组成，每个反应都在酶的作用下完成。4、其他糖类作为碳源和能源时，是通过葡萄糖或其他中间产物并入糖酵解途径的。5、反应中生成的NADH2不能积存，必须被重新氧化为NAD后，才能继续不断地推动全部反应。在不同的有机体和不同条件下，H的受体不同，丙酮酸的去路也不同。,+2ATP,二、糖酵解途径的特点,糖酵解中的能量变化,调节主要是通过己糖激酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶等三个激酶完成，所催化的三个反应是不可逆的，只参与糖酵解，不参与糖的异生。激酶活性受细胞能荷调节：能荷=(ATP+ADP)(ATP+ADP+AMP)ATP含量高：抑制磷

16、酸果糖激酶和丙酮酸激酶，减少糖酵解；ATP转化为ADP、AMP：解除抑制；同时ADP、AMP激活已糖激酶和磷酸果糖激酶；其产物6-磷酸葡萄糖、1，6-二磷酸果糖、3-磷酸甘油醛又激活丙酮酸激酶；无机磷也是调节者，它能解除6-磷酸葡萄糖对己糖激酶的抑制，加快糖酵解。柠檬酸、脂肪酸和乙酰CoA通过抑制丙酮酸的转化来抑制糖酵解途径。,三、糖酵解调节机制,乙醇、乳酸、乙醛、丙酸、丁醇、琥珀酸、醋酸等,从丙酮酸出发可以得到,C6H12O6+2ADP+3H3PO4 2CH3CH2OH+2CO2+2ATP+104.6KJ,理论转化率：246.05/180.1=51.1%,第三节 酒精发酵机制,一、酒精生成机

17、制,该乙醇发酵过程只在pH3.54.5以及厌氧的条件下发生。,概念：有氧条件下，发酵作用受抑制的现象（或氧对发酵的抑制现象）。,通风对酵母代谢的影响,二、巴斯德效应,1、糖代谢进入TCA环 柠檬酸、ATP 抑制果糖磷酸激酶的合成 6-P-葡萄糖（积累）反馈抑制己糖激酶 抑制葡萄糖进入细胞内 葡萄糖利用降低 2、磷酸果糖激酶活性下降 1，6二磷酸果糖 丙酮酸激酶活性 磷酸烯醇式丙酮酸积累 反馈抑制已糖激酶，降低糖酵解速度,厌氧条件下酵母菌进行酒精发酵，葡萄糖的消耗速度很快；而在有氧条件下，酵母菌进行呼吸作用，糖的消耗速度较低，酒精产量也降低。,概念：,原理：,三、酒精发酵中的副产物,主产物：乙醇

18、、CO2酵母酒精发酵 醇类（杂醇油）醛类（糠醛）酸类（琥珀酸）酯类,副产物,影响：消耗糖分，带来杂质，提高或降低产品质量。,1、杂醇油,C原子数大于2的脂肪族醇类的统称；主要由正丙醇、异丁醇、异戊醇和活性戊醇组成，沸点高、颜色呈黄色或棕色，具有特殊气味。酒类风味物质，质量指标，适量。,（1）氨基酸氧化脱氨作用：氨基酸将氨基传递给a-酮戊二酸，然后经酸、醛途径生成相应的醇。缬氨酸 异丁醇 异亮氨酸 活性戊醇酪氨酸 酪醇 苯丙氨酸 苯乙醇,亮氨酸,酮戊二酸,酮异己酸,转氨酶,+,谷氨酸,异戊醇,异戊酸,醇脱氢酶,2、杂醇油的形成途径：,（2）由葡萄糖直接形成：,酮酸（碳原子低的）,活性乙醛,酮酸（

19、碳原子高的）,还原、异构、脱水,醇,缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸,醇,（3）正丙醇的形成,苏氨酸,氨基2丁烯酸,脱水酶,丁酮酸,还原、脱氨,脱羧,醛,正丙醇,还原,3、影响杂醇油形成的因素,不同菌种差异较大：40ppm200ppm。酵母的杂醇油生成量与醇脱氢酶活性关系密切，该酶活力高，杂醇油生成量大。,菌种,一般发酵温度高，高级醇生成量高；通风有利于高级醇生成。高级醇的生成与乙醇的生成是平行的，随乙醇的生成而生成。,存在氨基酸会增加高级醇生成量；N含量低，无法将葡萄糖转化得到的酮酸转化为氨基酸，进一步合成蛋白质，酮酸脱羧还原成高级醇；,培养基组成,发酵条件,第三节 甘油的合成机制,抗不良环境当环境

20、渗透压升高，酿酒酵母将合成并在胞内积累甘油以维持细胞内外的渗透压平衡；当在缺氧条件下生长时，酿酒酵母将合成并在胞内积累甘油以维持细胞的氧化还原平衡。,1、甘油发酵的细胞保护机理：,酵母菌中的乙醇脱氢酶活性很强，乙醛作为氢受体被还原成乙醇的反应进行得很彻底，因此，在乙醇发酵中甘油的生成量很少。,如果采取某些手段阻止乙醛作为氢受体时，磷酸二羟丙酮则替代乙醛作为氢受体形成甘油，这样发酵转为甘油发酵（酵母型发酵）。,一、亚硫酸盐法甘油发酵（酵母型发酵）酵母菌在酒精发酵时，如加入亚硫酸氢钠等盐类，它能与乙醛起加成作用，生成难溶的结晶状亚硫酸纳加成物，这样就使乙醛不能作为受氢体，而迫使磷酸二羟丙酮作为受氢

21、体，在-磷酸甘油脱氢酶（NAD为辅酶）催化下生成-磷酸甘油，后者在-磷酸甘油磷酸酯酶催化下生成-甘油。,C6H12O6+NaHSO3 甘油+乙醛亚硫酸钠+CO2,二 碱法甘油发酵（酵母型发酵）酒精酵母的发酵液在保持碱性（pH7.6以上）的条件下，乙醛不能作为正常的受氢体，乙醛在碱性溶液里分子乙醛之间发生歧化反应，相互氧化还原，生成等量的乙醇和乙酸。此时，由磷酸甘油醛脱氢生成的 NADH用来还原磷酸二羟丙酮，并进而生成甘油,乙酸,2C6H12O6+H2O 2甘油+乙酸+乙醇+2CO2,第四节 乳酸发酵机制,乳酸细菌能利用葡萄糖及其他相应的可发酵的糖产生乳酸，称为乳酸发酵。由于菌种不同，代谢途径不

22、同，生成的产物有所不同，将乳酸发酵又分为同型乳酸发酵（产物中只有乳酸）、异型乳酸发酵（产物除乳酸外尚有乙醇，CO2）。,葡萄糖,3-磷酸甘油醛,磷酸二羟丙酮,2(1,3-二-磷酸甘油酸）,2乳酸 2丙酮酸,一、同型乳酸发酵 利用糖经糖酵解途径生成丙酮酸，丙酮酸还原产生乳酸。发酵产物中主要为乳酸的称为同型乳酸发酵。,2NAD+2NADH,4ATP,4ADP,2ATP 2ADP,同型乳酸发酵的特点：1mol的G产生2mol乳酸，理论转化率是100%。另外有很少量的乙醇、乙酸和二氧化碳等。,C6H12O62ADP 2CH3CHOHCOOH2ATP,德氏乳杆菌属（Lac.delbriickii）、乳酸

23、链球菌属（Streptococcus Lactis）、酪乳杆菌属（Lactobacillus Casei）、保加利亚乳杆菌（Lac.bulgaricus）等,二、异型乳酸发酵,1、6-磷酸葡萄糖酸的途径（磷酸酮解途径）,2、双歧途径（磷酸酮糖途径）,葡萄糖,6-磷酸葡萄糖,6-磷酸葡萄糖酸,5-磷酸木酮糖,3-磷酸甘油醛,乳酸,乙酰磷酸,NAD+NADH,NAD+NADH,ATP ADP,乙醇 乙醛 乙酰CoA,2ADP 2ATP,-2H,-CO2,6-磷酸葡萄糖酸的途径,葡萄糖经6-磷酸葡萄糖生成5-磷酸核酮糖，再经差向异构作用生成5-磷酸木酮糖；后者经磷酸解酮酶催化，分解为3-磷酸甘油醛和

24、乙酰磷酸。乙酰磷酸经磷酸转乙酰酶作用变为乙酰CoA，再经乙醛脱氢酶作用生成乙醇。而3-磷酸甘油醛经EMP途径生成丙酮酸。后者经乳酸脱氢酶催化还原为乳酸。,总反应式为：,此过程1mol己糖生成1mol乙醇、lmol二氧化碳和1mol乳酸。乳酸对糖转化率50。,C6H12O6+ADP+Pi CH3CHOHCOOH+CH3CH2OH+CO2+ATP,肠膜明串株菌（Leuconostoc mesenteroides）、葡聚糖明串珠菌（L.dextranicum）等,双歧途径,2葡萄糖 2葡萄糖-6-磷酸6-磷酸果糖 6-磷酸-果糖,4-磷酸-赤藓糖 乙酰磷酸,2木酮糖-5-磷酸,2甘油醛-3-磷酸 2

25、乙酰磷酸,2乳酸,2乙酸,乙酸,磷酸己糖解酮酶,磷酸戊糖解酮酶,逆HMP途径,同EMP,乙酸激酶,双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum)进行的乳酸发酵是一条磷酸解酮酶途径。该途径的特点是：有两个磷酸酮解酶参与；在没有氧化作用和脱氢作用下，2分子G分解为3分子乙酸和2分子3-磷酸甘油醛。接着，在3-磷酸甘油醛脱氢酶和乳酸脱氢酶的参与下，3-磷酸甘油醛转化为乳酸，转化率为50%。,2C6H12O6 2CH3CHOHCOOH+3CH3COOH+2ATP,微生物的代谢途径一般都不是单一的，因此，不论同型乳酸发酵还是异型乳酸发酵，实际代谢产物都不象代谢途径中那样单纯，所以，两类乳酸发酵的代谢产物没有不可逾越的界限。在微生物的分类研究中，通常把发酵1mol葡萄糖产生的乳酸少于1.8mol，同时还产生较多的乙醇、CO2或乙酸、甘油、甘露醇等产物的乳酸菌称为异型乳酸菌。同型乳酸菌发酵的微生物已经用来发酵产生乳酸。异型乳酸发酵的微生物，例如双歧杆菌，已经用于发酵生产活菌饮料，并越来越受重视。,