《子克隆的载体》PPT课件.ppt

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1、第三章 分子克隆的载体,质粒（plasmid）,噬菌体或病毒DNA,考斯质粒（cosmid）与噬菌粒,人造染色体载体,载体的功能及特征,载体的定义,载体的功能及特征,将外源DNA或基因携带入宿主细胞的工具称为载体(vector),载体的功能,运送外源基因高效转入受体细胞,为外源基因提供复制能力或整合能力,为外源基因的扩增或表达提供必要的条件,载体的特征,分子较小，可携带比较大的DNA片段。能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制酶又要最少的切割位点（多克隆位点 multiple cloning sites，MCS）。有合适的选择标记，易于筛选。

2、有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达，并且尽可能是高效的表达。从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。,基因克隆,利用重组DNA技术分离目的基因，称为基因克隆(gene clone),克隆(clone),动词：指从单一祖先产生同一的DNA分子群体 或细胞群体的过程。名词：指从一个共同祖先无性繁殖下来的一群 遗传上同一的DNA分子、细胞或个体所 组成的特殊的群体。,基因文库gene library,由大量的含有基因组DNA（即某一生物的全部DNA序列）的不同DNA片段的克隆所构成的群体，称为基因文库(gene library),功能克隆载体:克隆

3、一个基因或DNA片段表达载体:用于一个基因的蛋白表达整合载体:把一个基因插入到染色体组中,载体的分类,来源：质粒载体plasmid 噬菌体载体phage 柯斯质粒载体cosmid 真核细胞克隆载体,载体的种类和特征,第一节 质粒（plasmid）载体,质粒是一种独立于染色体外的遗传因子，可自身复制和表达（但依赖于宿主编码的酶和蛋白质）,一、质粒的基本特征,大多数为超螺旋的双链共价闭合环状分子DNA(coverlently closed circle DNA,cccDNA),少数为线性,大小为1-200kb，也有更大,1.质粒的基本概念,常见于原核细菌和真菌中,一、质粒的基本特征,质粒的表型：抗

4、生素的抗性，产生抗生素、降解复杂有机化合物、产生毒素（如大肠杆菌素、肠毒素）、合成限制性内切酶和修饰酶、生物固氮和杀虫等,克隆的质粒载体 允许外源的DNA插入，储存。主要是DNA水平上的操作。基因表达的质粒载体 允许外源DNA的插入、储存和表达。,质粒DNA的构型：SC型 共价闭合环形DNA（cccDNA）OC型 开环DNA（open circular DNA,ocDNA）L 型 线性DNA（linear DNA,LDNA）,作为载体的质粒都含有三种共同的组分：复制基因（replicator）选择性记号 克隆位点,L,OC,SC,2.质粒的基本特征,1）质粒的自主复制性,质粒能利用寄主细胞的D

5、NA复制系统进行自主复制质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：松弛型复制控制的质粒 10-60 拷贝 relaxed plasmid严紧型复制控制的质粒 1-3 拷贝 stringent plasmid,2）质粒的不相容性plasmids incompatibility,是指在没有选择压力的情况下，两种亲源关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。,在第二个质粒导入后，在不涉及 DNA 限制系统时出现的现象。质粒的不相容性分子基础，主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的。不相容的质粒一般都利

6、用同一复制系统，从而导致不能共存于同一宿主中。两个不相容性质粒在同一个细胞中复制时，在分配到子细胞的过程中会竞争，随机挑选，微小的差异最终被放大，从而导致在子细胞中只含有其中一种质粒。,不相容群指那些具有不相容性的质粒组成的一个群体，一般具有相同的复制子。在大肠杆菌中现已发现 30 多个不相容群，如 ColE1 和 pMB1，pSC101 和 p15A。,A,B,3）质粒的可转移性transferring,在自然条件下，很多质粒可通过称为细菌接合（conjugation）的作用转移到新的宿主细胞内。,要素：移动基因 mob，转移基因 tra，顺式因子 bom 及其内部的转移缺口位点 nic。,

7、值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质粒的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由 bom 和mob 基因决定,革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：,接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等非接合型质粒 不能在天然条件下独立地发生接合作用，如Col、R的其它成员,4）携带特殊的遗传标记,野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这是寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：,物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物,物质合成 抗生素、细菌毒素、有机碱,这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义,标记基

8、因marker gene,选择标记基因selective marker gene,用于鉴别目标DNA的存在，将成功转化了质粒的宿主挑选出来,抗生素抗性基因是目前使用最广泛的选择标记,氨苄青霉素抗性基因（Ampicillin resistance gene,ampr）四环素抗性基因（Tetracycline resistance gene,tetr）氯霉素抗性基因（chloramphenicol resistance gene,Cmr,cat）卡那霉素和新霉素抗性基因（kanamycin/neomycin resistance gene,kanr,neor）,琥珀突变抑制基因 supF在基因的编

9、码区中，若某个密码子发生突变后变成终止密码子，则称这样的突变为赭石突变（突变为 UAA），或琥珀突变（突变为 UAG），或乳白突变（突变为 UGA）。supF 基因编码细菌的抑制性 tRNA，可在 UAG 密码子上编译酪氨酸。如果在某一宿主中含具琥珀突变的 tetr 基因和 ampr 基因，只有当宿主含有 supF 基因时才会对 Amp 和 Tet 具有抗性。,正向选择标记，表达一种使某些宿主菌致死的基因产物，而含有外源基因片段插入后，该基因便失活。如蔗糖致死基因 SacB，来自淀粉水解芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），编码果聚糖蔗糖酶。在含蔗糖的培养基上 sa

10、cB 基因的表达对大肠杆菌来说是致死的，因此该基因可用于插入失活筛选重组子。,筛选标记基因,主要用来区别重组质粒与非重组质粒，当一个外源 DNA 片段插入到一个质粒载体上时，可通过该标记来筛选插入了外源片段的质粒，即重组质粒。,-互补插入失活,-互补是指 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的-半乳糖苷酶（-galactosidase，由 1024 个氨基酸组成）阴性的突变体之间实现互补。-互补是基于在两个不同的缺陷-半乳糖苷酶之间可实现功能互补而建立的。,-互补,lacZ 基因是乳糖 lac 操纵子中编码-半乳糖苷酶的基因，乳糖及其衍生物可诱导其表达。乳糖既是

11、 lac 操纵子的诱导物，也是作用的底物。IPTG：异丙基-D-硫代半乳糖苷，乳糖的衍生物，可作为 lac 操纵子的诱导物，但不能作为反应的底物；X-gal：5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷，可作为 lac 操纵子的底物，但不能作为诱导物。X-gal 可作生色剂，被-半乳糖苷酶分解后可产生兰色产物，可使菌落或噬菌斑呈兰色。,乳糖操纵子(lac operon)的结构,调控区,功能互补,插入失活,通过插入失活进行筛选的质粒主要有 pBR322，该质粒具有四环素抗性基因（tetr）和氨苄青霉素抗性基因（ampr）两种抗性标记。当外源 DNA 片段插入 tetr 基因后，导致 tetr 基因失活

12、，变成只对氨苄青霉素有抗性。这样就可通过对抗生素是双抗还是单抗来筛选是否有外源片段插入到载体中。,二、质粒载体的种类,pBR322之前天然质粒：没有经过以基因克隆为目标的体外修饰改造的质粒。在大肠杆菌中，常见的可用于基因克隆的天然质粒有EolE1、RSF2124和pSC101等，但存在一定的局限性。,分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等,转化效率与质粒大小成反比，质粒15kb，转化效率成为限制因素,质粒越大，越难用限制性酶切进行鉴定。,质粒越大，拷贝数越低,2.pBR322之后调整载体的结构，提高载体的工作效率pBR322 pUC系列质粒去掉多余片段，提供多克隆位点，筛选标记增

13、加辅助功能，表达载体（expression vector），穿梭载体（shuttle vector）,3.克隆载体,1）pBR322质粒载体,松弛型复制,氯霉素可扩增,拷贝数 50-100/cell,用于基因克隆,以Ampr和Tetr为选择性标记，克隆位点在这两个选择性标记的单酶切位点上。选择AmprTets或AmpsTetr的重组子，可通过插入失活来进行筛选,2）pUC18/19质粒载体,来自pBR322拷贝数 2000-3000/cell,用于基因克隆和测序,装有多克隆位点（MCS）,正选择颜色标记 lacZ-互补,3）pUC118/119质粒载体,由 pUC18/19 增加了一些功能片段

14、改造而来，大小为 3162bp，相当于在 pUC18/19 中增加了带有 M13 噬菌体 DNA 合成的起始与终止以及包装进入噬菌体颗粒所必需的顺式序列。,用途：制备单链DNA 用于:DNA序列测定、定点诱变、制备探针,4）pGEM-3Z/4Z质粒载体,由 pUC18/19 增加了一些功能片段改造而来，大小为 2.74kb与 pUC18/19 相比，在多克隆位点的两端添加了噬菌体的转录启动子，如 Sp6 和 T7 噬菌体的启动子。pGEM-3Z 和 pGEM-4Z 的差别在于二者互换了两个启动子的位置。用途：体外转录得到RNA，用于体外蛋白质的合成或用作克隆邻近DNA片段的探针,5）多功能质粒

15、载体,在上述载体的基础上，人们设计出一些多功能的质粒载体，这类质粒载体综合了以上质粒的特点。除了作为质粒载体基本要素外，综合了上述功能要素，如多克隆位点、-互补、噬菌体启动子和单链噬菌体的复制与包装信号。典型的这类质粒有 pBluescriptKS（），这类质粒一般由 4 个质粒组成一套系统，其差别在于多克隆位点方向相反（根据多克隆位点两端 Kpn 和 Sac 的顺序，用 KS 或 SK 表示），或单链噬菌体的复制启始方向相反（或者说，引导 DNA 双链中不同链合成单链 DNA，用+或-表示）,4.表达载体expression vector,该类载体是在常规克隆载体的基础上衍生而来的，主要增添

16、了强启动子，以及有利于表达产物分泌、分离或纯化的元件，如PET系列载体。详细情况见后文,第二节 噬菌体载体 phage vectors,头部,尾管,尾锥,尾丝,C、B、D、E分别指相应基因编码的颗粒蛋白,一、噬菌体的分子生物学,噬菌体是感染大肠杆菌的溶源性噬菌体，在感染宿主后可进入溶源状态，也可进入裂解循环。基因组 双链 DNA 分子，实际大小为 48502bp 在噬菌体颗粒内，基因组 DNA 呈线性，其两端的 5末端带有 12 个碱基的互补单链（粘性末端）,当 噬菌体 DNA 进入宿主细胞后，其两端互补单链通过碱基配对形成环状 DNA 分子，而后在宿主细胞的 DNA 连接酶和旋促酶（gyra

17、se）作用下，形成封闭的环状 DNA 分子，充当转录的模板此时，噬菌体可选择进入裂解生长状态（lytic growth），大量复制并组装成子代噬菌体颗粒，导致宿主细胞裂解。经过 4045min 的生长循环，释放出约 100 个感染性噬菌体颗粒（每个细胞）或者进入溶源状态（lysogenic state），将噬菌体基因组 DNA 通过位点专一性重组整合到宿主的染色体 DNA 中，并随宿主的繁殖传给子代细胞,感染周期,/溶原,溶源阶段(整合到寄主染色体上),裂解阶段(复制和释放),噬菌体基因组至少可编码 30 个基因，它们的分布和排列与其功能有一定关系根据执行功能的不同可将基因组分为三个区：左边区

18、域包括从基因 Nu1 到基因 J 之间的基因，其产物用于噬菌体 DNA 的包装和噬菌体颗粒的形成。中间区域（基因 J 右边至 gam）编码基因调节、溶源状态的发生和维持以及遗传重组所需要的基因。其中许多基因对裂解生长是非必须的，在构建载体时可以去掉，用外源 DNA 片段替代。右边区域（基因 gam 右边至基因 Rz）包含噬菌体复制和裂解宿主菌所必须的基因。,3,3,溶菌控制基因,晚期控制基因,DNA合成控制基因,阻遏基因,早期控制基因,阻遏基因,重组基因,删除与整合基因,cos,-DNA,头部合成基因,尾部合成基因,5 TCCAGCGGCGGGG,COS,CCCGCCGCTGGA 5,COS,

19、噬菌体生物学特性：生物结构,（一）噬菌体的发育调节,1吸附（adsorption）2立即早期转录（immediate early transcription）3延迟早期转录（delayed early transcription）4溶源和裂解的感染分化5进入裂解生长6溶源化,（二）噬菌体的可取代区,在溶源状态，噬菌体 DNA 整合在半乳糖代谢基因 gal 和生物素合成基因 bio 之间。噬菌体在某些条件下，会从宿主染色体上切离出来，进入裂解循环。切离和整合是相互对立的过程，在不同重组酶的作用下，导致切离或整合的发生。,1.区域,溶源化噬菌体的正确切离正常噬菌体,不正确切离不正常噬菌体 gal替

20、换或 bio替换J 基因与 Cro 基因之间的 DNA 被 ga1 基因或 bio 基因替换后，不影响 噬菌体裂解生长。,2.大小,占噬菌体 DNA 的 1/3，主要包含控制噬菌体进入溶源状态的调节基因和功能基因。60%区域为裂解生长所必须的，左臂：约 20kb，含有编码噬菌体头部和尾部蛋白的基因，即从基因 A 至基因 J 的区域右臂：约为 8-10kb，从 PR 启动子到右侧 cos 位点可插入的外源DNA片段大小为9-23kb,二、噬菌体的选择标记,1基因组大小 噬菌体的遗传学研究发现，重组 噬菌体的基因组 DNA 太大或太小会影响其存活能力。当基因组 DNA 长度为野生型 噬菌体基因组

21、DNA 的78105%时，不会明显影响存活能力。野生型 噬菌体基因组 DNA 为 48kb，若用外源 DNA 片段完全替换可取代区，外源 DNA 片段的大小将在 9-23kb 范围内。,2lacZ 基因lacZ 基因也可用于 噬菌体载体，通过插入或替换载体中的-半乳糖苷酶基因片段，在 IPTG/X-gal 平板上可通过噬菌斑的颜色，筛选重组噬菌体。,hfl+E.coli 中，噬菌体可高效率地进入溶源状态。hfl-E.coli 中，基因 c（基因 c 的正调节物）产物累积到较高水平。hfl-可增加基因 c 的产物，从而使裂解生长受到抑制，高效地进入溶源状态。外源 DNA 片段插入基因 c 中，将

22、高频率地使 hfl-E.coli 进入裂解生长状态。cI基因失活后将导致噬菌体不能溶原化，产生清晰的噬菌斑。相反，产生混浊的噬菌斑。在构建基因文库时，可提高排除非重组噬菌体的效率，从而降低对基因文库进行筛选的劳动强度。,3基因 c 失活 p52c基因的表达促进 噬菌体进入溶源状态，基因 c产物活性受到影响会促进 噬菌体进入裂解循环。,4Spi 筛选Spi+：野生型 噬菌体在带有 P2 原噬菌体的溶源性 E.coli 中的生长会受到限制的表型，即对 P2 噬菌体的干扰敏感（sensitive to P2 interference）。Spi-：如果 噬菌体缺少两个参与重组的基因 red 和 gam

23、，同时带有 chi 位点，并且宿主菌为 rec+，则可以在 P2 溶源性 E.coli 中生长良好因此，通过噬菌体载体 DNA 上的 red 和/或 gam 基因的缺失或替换，可在 P2 噬菌体溶源性细菌中鉴别重组和非重组噬菌体。,三、代表性噬菌体载体,插入型载体（insertion vectors）：通过特定的酶切位点允许外源 DNA 片段插入的载体置换型载体（replacement vectors）：允许外源 DNA 片段替换非必须 DNA 片段的载体,噬菌体载体相对于质粒载体来说，克隆片段较大，所以一般用于cDNA文库或基因组文库的构建。,(一)插入型载体：cI基因插入失活：如 gt10

24、、NM1149等载体，在cI基因上有EcoR I的酶切位点。外源基因插入后将导致cI基因的失活。cI基因失活后将导致噬菌体不能溶原化，产生清晰的噬菌斑。相反，产生混浊的噬菌斑。lac Z基因插入失活：如charon16A载体，在非必需区段引入lac Z基因，在lac Z基因上有EcoR I位点，插入失活后利用X-gal法筛选（蓝白筛选）。,插入片段大小:6-11kb,1.gt10,43340bp插入片段大小:设计为6kb,理论为7.6kb仅在cI基因内有一个EcoR I的酶切位点用于克隆小的cDNA而设计,外源DNA量有限时选用较好,克隆效率高,2.gt11,43.7kb插入片段大小:0-7.

25、2kb特点:在最左侧可替代区置换了一段lac5基因,其编码区终止密码子前有一个EcoR I的酶切位点,该位点作为插入位点筛选:在lac-宿主菌中,非重组噬菌斑为蓝色用途:构建cDNA文库、基因组文库和表达融合蛋白,(二)置换型载体：对噬菌体DNA进一步改造而来，去掉大多数非必需片段，保留作为载体的必需左臂：含与包装蛋白有关的基因右臂：含与裂解生长有关的基因左右臂之间用一段填充片段（central stuffer）替换与溶源循环有关的片段,插入片段大小:9-23kb 主要用来构建基因组文库,1.EMBL 3/4,大小为 43kb，其左臂、右臂和填充片段的大小分别为 20kb、9kb 和 14kb

26、。从提高克隆效率角度来看，克隆 DNA 片段的大小为 9-23kb在填充片段中带有 red 和 gam 基因，当外源片段替换填充片段后，重组体将变成 red-gam-，同时载体上含有 chiC 位点，因此可用 P2 噬菌体的溶源性大肠杆菌进行 Spi 筛选重组体。在填充片段两端带有对称的多克隆位点，这两个载体的差别是多克隆位点的排列位置相反,2.Charon 4A大小为 45kb，其左臂、右臂和填充片段的大小分别为 19.5kb、11kb 和 14.7kb用Lac 5（乳糖操纵子的大部分系列，包括完整的Lac Z）替换入噬菌体的中间区段，同时将Lac 5作为选择标记，使用时用EcoRI水解，去

27、掉中间的片段，再与欲克隆片段在体外进行重组、包装。而后，感染E.coli使之在E.coli内繁殖，并裂解E.coli，形成空斑。置换型噬菌体是使用最广泛的载体。,四、噬菌体载体的克隆原理及步骤,步骤：1.通过裂解过程增殖载体2.载体与外源DNA的酶切。应用适当的核酸内切酶消化载体，除去可取代的DNA片段；3.外源DNA与载体的连接。将上述所得的DNA载体臂同外源DNA片段连接；4.重组噬菌体的体外包装。对重组体的DNA分子进行包装和增殖，以得到有感染性的重组噬菌体5.包装噬菌体颗粒的感染6.筛选,体外包装 噬菌体DNA体外重组后，一般必须经过体外包装，然后以噬菌体感染的方式将重组DNA导入E.

28、coli细胞内。这是因为以感染方式导入细胞的频率可达106108pfu/gDNA，而以转染的方式导入的频率仅为103105pfu/gDNA。噬菌体的包装限制为野生噬菌体DNA（约48.5 kb）的78%105%。,由于噬菌体包装时，当DNA的长度短于野生型的78%或超过105%时，噬菌体的活性就急剧下降。因此只包装它的野生型DNA（48.5KB）的78%-105%左右的DNA，要求载体DNA和外源DNA长度之和在3953kb之间。插入式载体可携带的外源DNA片段较置换型为小。,连接,2.组装,3.侵染,Charon 4A,根据噬菌斑的透明度或颜色来进行重组子的筛选,第三节 单链丝状噬菌体载体,

29、M13、f1、fd三种噬菌体组织形式相同，颗粒大小以及形状相近，DNA同源高达98%，少数序列差异分布在整个基因组中，大多数出现在丰余密码子的第三位置上，互补活跃，彼此间易重组在功能和构建载体方面视为等同,一、M13噬菌体载体一种含单链（+）DNA（ssDNA）的丝状大肠杆菌噬菌体，其基因组大小为6.4kb。基因组 90%以上的序列可编码蛋白质共有 11 个编码基因，基因之间的间隔区多为几个碱基。较大的间隔位于基因 和基因 以及基因 和基因 之间，其间有调节基因表达和 DNA 合成的元件。,M13噬菌体的特点感染E.coli后，在宿主细胞内会形成双链的复制型DNA（replication fo

30、rm DNA,RF DNA）。可以象质粒DNA那样在体外进行纯化和操作。成熟的噬菌体颗粒只感染具有性纤毛的菌株，携带 F 质粒的菌株可产生性纤毛,即仅能感染E.coli的F+细胞，这是因为这种噬菌体的感染位点在性菌毛上。但是无论是RF DNA或ss DNA都能转染E.coli的F+或F-细胞。噬菌体颗粒的大小是受其DNA的大小制约的，这一点正好与噬菌体相反。所以M13噬菌体并不存在包装限制的问题。,M13单链DNA噬菌体的生命周期,M13噬菌体的增殖1.吸附入侵F菌株的性纤毛 病毒 DNA 及附着于其上的基因蛋白进入宿主菌体内2.形成RF DNA 在宿主细胞内，感染性的单链噬菌体 DNA（+）

31、在宿主酶的作用下转变成环状ds DNAreplicative form DNA 复制型DNA,3.转录复制 从任意一个启动子都可以启动基因的转录，单方向地终止于下游的终止子。启动子和终止子的位置关系使得靠近终止子的基因转录更频繁4.滚环复制产生基因组ss-DNA 基因 蛋白在亲代 RF DNA 的正链特定位点上产生一个切口时，便启动噬菌体基因组进行滚环复制.完成一周后,由基因产物切割，环化，形成单位长度的单链基因组DNA在感染的开始15-20分钟，（+）DNARFDNA连续滚环复制,5.分泌excrete包装packaging当感染细胞内累计有 100-200 个 RF DNA 时，细胞内也产

32、生了足够的单链 DNA 结合蛋白，即基因蛋白。该蛋白可以抑制翻译活性，特别是抑制基因mRNA 的翻译，并且强烈地结合在新合成的正链DNA上，阻止其转化成 RFDNA。此时，DNA的合成几乎只产生子代正链DNA。基因蛋白/（+）ssDNA复合物移至细菌细胞膜，基因产物脱落，（+）ssDNA溢出时被衣壳蛋白所包被。,由于病毒基因组并不需要插入一个预先形成的结构之中，对被包被的ssDNA的大小并无严格限制，相反，其长度却随DNA的量而变化。曾发现多个基因组的颗粒，也曾克隆过长6倍的外源片段感染宿主后不裂解宿主细胞，而是从感染的细胞中分泌出噬菌体颗粒，宿主细胞仍能继续生长和分裂。但生长速率仅为正常的1

33、/2-3/4，每个细胞每一代产生数百个噬菌体颗粒,M13噬菌体在感染细胞中的复制,2.M13mp载体系列,mp 载体系列都是从同一个重组 M13 噬菌体（M13mpl）改造而来的。在 M13mpl 载体中，间隔区内的 Hae 位点插入了一小段大肠杆菌 DNA，引入互补筛选。,3M13mpl8 和 M13mpl9M13mpl8 和 M13mpl9 这两个载体含有 13 个不同的酶切位点，可供插入由多种各不相同的限制酶切割而成的 DNA 片段，这两种载体只是在 lacZ 区内不对称的多克隆区的方向上有所不同。,4.M13系列载体的优点,有MCS，便于克隆不同的酶切片段,X-gal显色反应，可供直接

34、选择,无包装限制，克隆能力大,可以克隆双链DNA分子中的每一条链,外源基因由M13mp8向M13mp9载体的转移,5.M13载体的缺点,插入外源DNA后，遗传稳定性显著下降,外源DNA总是以单方向插入 实际克隆能力小于1500bp。,虽无包装限制，并非无限包装！,三、噬菌粒（phagemid）定义：带有丝状噬菌体复制起点的质粒载体组成：具有 ColE1 复制起点、抗生素抗性选择标记的质粒，以及丝状体噬菌体的间隔区。此间隔区含噬菌体 DNA 合成的起始与终止及噬菌体颗粒形态发生所必需的全部顺式作用序列。含噬菌粒的细菌被噬菌体感染后，基因 蛋白可作用于噬菌粒的间隔区，启动滚环复制产生 ssDNA

35、并进行包装,常用的噬菌粒载体pUC118和pUC119 1.具有较小分子量的共价、闭合、环形的基因组DNA，可克隆10kb的外源DNA片段，并易于进行分离与操作；2.编码一个ampr基因作为选择记号，因此只有携带pUC118或pUC119噬菌粒载体的大肠杆菌转化子细胞，才能够在含有氨苄青霉素的培养基中生长，便于转化子的选择；3.拷贝数含量高，每个寄主可高达500个，所以只要用少量的大肠杆菌细胞培养物，便可制备出大量的载体DNA；4.存在着一个多克隆位点区，因此许多种不同类型的外源DNA片段，不经修饰便可直接插入到载体分子上,5.由于多克隆位点区阻断了大肠杆菌lacZ基因的5-端编码区，可按照I

36、PTG组织化学显色反应试验，筛选重组子；6.lacZ基因是置于lac启动子的控制之下，这样插入的外源基因便会以融合蛋白质的形式表达；7.含有质粒的复制起点，在没有辅助噬菌体的情况下，克隆的外源基因可以像质粒一样按常规的方式，复制形成大量的双链DNA分子8.带有一个M13噬菌体的复制起点，在有辅助噬菌体感染的寄主细胞中，可以合成出单链DNA拷贝，并包装成噬菌体颗粒分泌到培养基中,9.在pUC118和pUC119这两个载体中，多克隆位点区的核苷酸序列取向是彼此相反的，于是它们当中的一个可转录克隆基因的正链DNA，另一个则可转录出负链DNA；10.可以直接对克隆的DNA片断进行核苷酸的序列测定，免去

37、了从质粒载体到噬菌体的这一烦琐的亚克隆步骤。,pBluescript噬菌粒载体基本结构：1.在多克隆位点的两侧，有一对T3和T7噬菌体的启动子，可以定向指导外源基因的转录活动；2.同时具有一个单链噬菌体M13或f1的复制起点和一个来自ColE1质粒的复制起点，在不同的情况下，可以采取不同的复制形式，分别合成单链或双链的DNA；3.编码有一个氨苄青霉素抗性基因，供作转化子记号；4.含有lacZ基因，可用X-gal-IPTG组织显色反应法筛选噬菌粒载体。,用于体外转录,第四节 粘粒载体cosmid vector,cosmid载体：也称粘粒、柯斯载体。一类用于克隆大片段DNA的载体，它是由噬菌体的c

38、os（cohesive）末端及质粒（plasmid）重组而成的载体。cosmid载体带有质粒的复制起点、克隆位点、选择性标记以及噬菌体用于包装的cos末端等，因此该载体在体外重组后，可利用噬菌体体外包装的特性进行体外包装，利用噬菌体感染的方式将重组DNA导入受体细胞。但它不会产生子代噬菌体，而是以质粒DNA的形式存在于细胞内。,柯斯质粒载体的特点具有噬菌体的特性 能像l-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞 具有质粒载体的特性能像质粒那样在受体细胞中自主复制具有较高容量的克隆能力装载量大（45 kb）且克隆片段具有一定的大小范围具有与同源性序列的质粒进行重组的能力,不能体内包装，不裂解受

39、体细胞,重组操作简便，筛选容易,柯斯质粒pHC79系由质粒pBR322和噬菌体的cos位点的一段DNA构成全长4.3kb,设计构建的柯斯质粒一般长57kb。其上的cos位点的一个重要作用是识别噬菌体的外壳蛋白。凡具有cos位点的任何DNA分子只要其长度相当于噬菌体基因组，就可以同外壳蛋白结合而被包装成类似噬菌体的颗粒。因此，插入柯斯质粒的外源DNA可大于40kb。重组的柯斯质粒可象噬菌体一样感染大肠杆菌，并在细菌细胞中复制。,Formation of a cosmid clone,C)Packaging and infect,Ligation to cleaved cosmid vector

40、molecules can produce vector-target concatemers,resulting in a large exogenous DNA fragment flanked by cos sequences.,采用柯斯质粒作载体的问题,载体自连。载体自身只相当于可以插入片段的1/10左右，因此往往会出现载体同载体自身连接，结果在一个重组分子内可有几个柯斯质粒载体连在一起。但用碱性磷酸酶处理，可阻止载体分子自身连接；,外源DNA片段自连。大小不等的外源片段相互连接后插入同一个载体分子，结果使在基因组内本来不是相邻的片段错乱地连接成一个片段，会影响实验结果的分析，后来专门

41、选出3045kb的外源DNA插入载体DNA，此时，每个载体只可能插入一个外源片段，因为如果二个片段，则将超过包装成噬菌体颗粒的限度；,细菌的菌落体积远大于噬菌斑，因此如用柯斯质粒制备基因文库，则筛选所需的含某一DNA片段的菌落很费时间。现虽建立了高密度菌落筛选法，但由于柯斯质粒制成的基因文库常常不太稳定，插入的大片段外源DNA有可能通过同宿主基因组交换而致丢失等，所以最常使用的还是噬菌体载体。,课堂作业:什么叫-互补,在载体构建中有何作用?,第五节 人工染色体载体Artificial chromosomes,人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要克隆数百甚至上千 kb 的DNA片段，此时考

42、斯质粒和噬菌粒载体的装载量也远远不能满足需要。将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体，它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。,人基因组十分庞大，约含4109bp，建立和筛选人的基因组文库，要求有容量更大的载体，酵母人工染色体（yeast artificial chromosome,YAC）载体应运而生。YAC含有酵母染色体端粒（telesome）、着丝点(centromere)及复制起点等功能序列，可插入长度达200-500kb的外源DNA，导入酵母细胞可以随细

43、胞分裂周期复制繁殖供作克隆，成为人基因组研究计划的重要工具,利用染色体的复制元件来驱动DNA片段复制的载体称为人工染色体载体,酵母人工染色体载体（yeast artificial chromosome,YAC）细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome,BAC）,P1噬菌体载体和P1人工染色体载体P1 phage vectors and P1 artificial chromosome vectors(PAC),一、酵母人工染色体载体（yeast artificial chromosome,YAC）,YAC 人工染色体载体是利用酿酒酵母（Saccharomy

44、ces cerevisiae）的染色体的复制元件构建的载体，其工作环境也是在酿酒酵母中。酿酒酵母的形态为扁圆形和卵形，生长的代时为 90 分钟；含 16 条染色体，其大小为 225-1900kb，总计有14106 bp；具真核 mRNA 的加工活性。,正常酵母人工染色体含有：四膜虫端粒（telomeric,tel)端粒重复序列（telomeric repeat，TEL）：定位于染色体末端一段序列，用于保护线状的 DNA 不被胞内的核酸酶降解，以形成稳定的结构。酵母自主复制序列（autonomously replication sequences，ARS)一段特殊的序列，含有酵母菌中 DNA 进

45、行双向复制所必须的信号。酵母着丝点(centromere,CEN)有丝分裂过程中纺锤丝的结合位点，使染色体在分裂过程中能正确分配到子细胞中。在 YAC 中起到保证一个细胞内只有一个人工染色体的作用。如 pYAC4 使用的是酵母第四条染色体的着丝粒 酵母的选择标记(TRP1、URA1),YAC 载体的选择标记主要采用营养缺陷型基因，如色氨酸、亮氨酸和组氨酸合成缺陷型基因 trp 1、leu 2和 his 3、尿嘧啶合成缺陷型基因 ura3 等，以及赭石突变抑制基因 sup4,与 YAC 载体配套工作的宿主酵母菌（如AB1380）的胸腺嘧啶合成基因带有一个赭石突变 ade 2-1。带有这个突变的酵

46、母菌在基本培养基上形成红色菌落，当带有赭石突变抑制基因 sup4 的载体存在于细胞中时，可抑制 ade 2-1基因的突变效应，形成正常的白色菌落。利用这一菌落颜色转变的现象，可用于筛选载体中含有外源 DNA 片段插入的重组子。,pYAC4：当用 BamH 切割成线状后，就形成了一个微型酵母染色体，包含染色体复制的必要顺式元件，如自主复制序列、着丝粒和位于两端的端粒。这些元件在酵母菌中可以驱动染色体的复制和分配，从而决定这个微型染色体可以携带酵母染色体大小的 DNA 片段。YAC 载体的原理性工作流程：对于 BamH切割后形成的微型酵母染色体，当用 EcoR或 Sma 切割抑制基因 sup4 内

47、部的位点后形成染色体的两条臂，与外源大片段 DNA 在该切点相连就形成一个大型人工酵母染色体，通过转化进入到酵母菌后可象染色体一样复制，并随细胞分裂分配到子细胞中去，达到克隆大片段DNA 的目的。装载了外源 DNA 片段的重组子导致抑制基因 sup4 插入失活，从而形成红色菌落；而载体自身连接后转入到酵母细胞后形成白色菌落。这些红色的装载了不同外源 DNA 片段的重组酵母菌菌落的群体就构成了 YAC 文库。YAC 文库装载的 DNA 片段的大小一般可达 200-500kb，有的可达 1Mb 以上，甚至达到 2Mb。,YAC 载体的工作原理,YAC 载体功能强大，但有一些弊端。这主要表现在 3

48、个方面：在 YAC 载体的插入片段会出现缺失（deletion）和基因重排（rearrangement）的现象容易形成嵌合体。嵌合就是在单个 YAC 中的插入片段由 2 个或多个的独立基因组片段连接组成。嵌合克隆约占总克隆的 5%50%YAC 染色体与宿主细胞的染色体大小相近，影响了 YAC 载体的广泛应用,二、细菌人工染色体载体（Bacterial artificial chromosome,YAC）,1F 质粒大肠杆菌的 F 因子是一个约 100kb 的质粒。它编码60多种参与复制、分配和接合过程的蛋白质（Willetts and Skurray，1987）。虽然F因子通常以双链闭环DNA

49、（1-2个拷贝/细胞）的形式存在，但它可以在大肠杆菌染色体中至少30个位点处进行随机整合（Low，1987）。携带F因子的细胞，或以游离状态或以整合状态表达三根发样状的F菌毛。F菌毛为供体与受体细胞之间产生性接触所必需。,2细菌人工染色体是基于大肠杆菌的 F 质粒构建的，高通量低拷贝的质粒载体。每个环状 DNA 分子中携带:一个抗生素抗性标记一个来源于大肠杆菌 F 因子（致育因子）的严谨型控制的复制子 oriS（Shizuya et al.1992）一个易于 DNA 复制的由 ATP 驱动的解旋酶（RepE）三个确保低拷贝质粒精确分配至子代细胞的基因座（parA,parB,和 parC）。BA

50、C 载体的低拷贝性可以避免嵌合体的产生，减小外源基因的表达产物对宿主细胞的毒副作用。,Structure of a bacterial artificial chromosome(BAC),used for cloning large fragments of donor DNA.CMR is a selectable marker for chloramphenicol resistance.oriS,repE,parA,and parB are F genes for replication and regulation of copy number.cosN is the cos sit