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1、,实验1 孚尔根（Feulgen)核染色法,实验目的实验原理实验材料与药品实验方法注意事项实验作业思考问题,实验目的,掌握孚尔根核染色的方法。了解孚尔根染色的原理。,Schiff试剂 的组成及配制,Schiff试剂：即脱色亚硫酸品红。配制方法：溶解1g碱性品红于200ml煮沸的重蒸水中，轻轻摇动，继续煮5min使其完全溶解，冷却至55-50时过滤到棕色带塞子的玻璃瓶中，加入1M HCl 20 ml，继续冷却至25 左右，再加入1g硫代硫酸钠，摇动使之溶解，置黑暗低温处或冰箱内18-24小时后检查，试剂如透明无色或淡黄色即可使用。,实验原理,Na2S2O3+HCl亚硫酸根亚硫酸根+碱性品红无色的
2、亚硫酸品红Schiff试剂DNA在60，1mol/L HCl作用下形成半缩醛羟基，与Schiff试剂反应，形成紫红色化合物。,酸解使DNA醛基暴露,醛基与Schiff试剂发生显色反应,孚尔根核染色法是Feulgen和Rossonbek于1924年提出的鉴定细胞中DNA的组织化学方法。其优点是制片清洁、染色体清晰、组织软化好，易于压片。但对小型染色体（如玉米、水稻）效果较差。,实验材料与药品,洋葱根尖1mol/L 盐酸(常温和60)Schiff试剂45%醋酸,实验方法,水洗：把已经固定好的洋葱根尖用清水冲洗,再把它放入室温的1mol/L HCl中处理2-3min。将根尖换入60预热的HCl，置于
3、恒温水浴中，在600.5的条件下水解10min。吸出热HCl，换入室温1mol/L HCl再处理2min，然后水洗2-3次。吸净水分，加入Schiff试剂，盖上盖子，黑暗条件下染色30min或过夜。,小心倒出Schiff试剂,然后用水漂洗，去掉细胞中残存的一些有色分子。取根尖置于载玻片上，只保留分生区，用镊子夹碎后，再加一滴45%的醋酸，压片镜检。,固定与固定液,固定：将新鲜的活组织从生物体取下后，立即投入固定剂中，借助化学药品的作用，使细胞保持原有形态结构的一种手段。,固定的目的,迅速防止细胞的死后变化，防止自溶、腐败，尽量保持生长状态结构。使细胞中的蛋白质、脂肪、糖、酶等成分转变为不溶性物
4、质，以保持生前状态。使组织内各种物质成分产生不同的折射率，便于鉴定、观察。使不同组织成分对染料有不同的亲和力，便于染色。防止细胞过度收缩或膨胀，失去原有的形态结构。,固定液,简单固定液：如乙醇、甲醛、冰醋酸、升汞等。混合固定液：如Carnoys固定液、AF液（乙醇:甲醛=9:1),Carnoys固定液,Carnoys固定液：冰醋酸:氯仿:无水乙醇=1:3:6改良Carnoys固定液：冰醋酸:无水乙醇=1:3,预处理的目的及方法,目的：改变细胞质粘度，破坏和抑制纺锤体的形成，使染色体适度缩短和分散。方法：0.04-0.2%秋水仙素溶液2-4小时。对二氯苯饱和溶液3-5小时。0.002M(或0.0
5、3%)8-羟基喹啉1.5-2小时以上，室温。低温：1-4处理24小时。,HE XI UNIVERSITY,根冠,分生区,伸长区,成熟区,根尖形态与结构,注意事项,Schiff试剂小心取放，及时清洗吸取Schiff试剂的吸管。黑暗条件下染色。,实验作业,绘制你所观察到的图象，并说明是有丝分裂的哪一个时期，并注明放大倍数。,前期、中期、后期、末期,光学显微镜基本结构：1.照明灯(Lamp)2.聚光器(Condenser)3.载物台和切片夹(Mechanical stage and specimen retainer)4.推进器(Mechanical stage adjustment knob)5.
6、物镜(Objectives)6.粗细螺旋(Course and fine focus knob)7.8.目镜(Oculars),思考题,为什么要严格掌握DNA的水解条件？为什么实验材料从60盐酸中倒出后，还要放入室温的盐酸中呢？直接固定和经过预处理后固定的洋葱根尖，其分裂相有何不同？为什么RNA在此过程中不会着色？,为什么要严格掌握DNA的水解条件？,温度过低，时间过短：则DNA的水解不够彻底，醛基暴露不充分，染色会过浅。温度过高，时间过长：则DNA过度水解，游离的核苷酸会漂移到细胞质中，造成染色浅或不均一。,材料从60的盐酸倒出后温度还相当高，如果直接转入Schiff试剂中，则会使Schiff试剂发生分解影响效果。所以我们首先要把材料转入室温的盐酸溶液中，做一个缓冲以避免Schiff 试剂分解。,为什么要在实验材料从60盐酸中倒出后，再放入室温的盐酸中呢？,为什么RNA在此过程中不会着色？,由于在酸解条件下，RNA较DNA分子更加稳定，它的醛基难以游离，所以在用Schiff试剂染色时RNA分子不会着色。,洋葱的染色体数？,
