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1、1,第三节 海藻组织培养概况,2,根据海藻材料的不同，海藻组织培养分为：海藻切段培养海藻愈伤组织培养海藻细胞培养海藻原生质体培养,一、海藻组织培养的分类,3,二、海藻组织培养研究历史,海藻组织培养开始于20世纪50年代，美国加州大学教授A.Gibor最早开始用褐藻(Cystoseira)进行海藻组织培养试验。Chen和Taylor(1978)最早报道对红藻门皱波角叉菜（Chondrus crispus）的髓部组织培养。,4,早期的海藻组织培养研究遇到了两大难题：获得无菌材料困难：海藻的表面寄生物多，且生长牢固，难以去除，必须采用剧烈的刷洗，而海藻的外表皮细胞无角质层类的保护层，很容易受损伤；同
2、时由于寄生的微生物种类多，数量大，所用的消毒剂和抗生素的量需加大，极易造成外植体畸形或死亡；海藻的基础研究落后，缺乏控制其生长和分化的x相关知识。,5,海藻的生活环境复杂具有许多不同于高等植物的特性，使得组织培养研究进展相对缓慢。从20世纪80年代开始，进行了许多海藻表面消毒和无菌孢子获得方法的研究。各种新的抗生素和清洗技术应用到大型海藻的组织培养中，许多海藻成功的实现了组织培养。同时对于愈伤组织产生的诱导条件进行了详细的研究，包括各种培养条件，不同的培养基，产生部位以及来源（组织块，细胞，原生质体）。,6,对于影响愈伤组织形成的物理因子，包括渗透压，琼胶强度，盐度（Robaina et al
3、.1990，Yokoya et al.1999），营养盐包括甘油、有机碳源(Garcia-Jimenez et al.1998)，植物生长调节物质(Bradley&Cheney 1990，Yokoya&Handro 1996，Yokoya 2000)等进行了详细的研究。据统计迄今已有六十余种大型海藻通过原生质体、组织切块实现了再生培养。,7,三、海藻组织培养的应用,海藻组织培养的优点：取材少，繁殖周期短、环境条件人为控制不受季节限制、易于工厂化生产等。,8,海藻组织培养主要应用在：,种苗培育研究次生代谢产物生产,9,种苗培育研究海藻种质库：我国在大型经济海藻的养殖与应用方面一直处于国际领先地位
4、，同时也是少数几个具有大型海藻种质库的国家之一，目前已保存了海带、裙带菜、紫菜的多个品系。苗种生产：利用植物离体繁殖进行大规模的苗种生产。目前，已在经济海藻的苗种生产研究中取得了一定的进展。,10,刘凤贤（1990）用壳聚多糖可将鹧鸪菜切段长成再生苗；朱仲嘉等（1992）羊栖菜组织培养芽生苗；裴鲁青等（1993）石花菜切段再生。贺丽虹等（2004）条斑紫菜单细胞固体培养成苗；曾庆国等（2004）以坛紫菜单个体细胞克隆培养获得的叶状体，再用组织培养技术形成纯和丝状体，然后进行海上养殖等。,11,次生代谢产物的生产,海洋植物含有特殊的成分，在工业和医药中有特殊的利用价值。温带红藻Agardhiel
5、la subulata含有稀有的通过脂肪氧化代谢产生的类花生酸（Graber等1996）和具有抗滤过性病原体活性的磺酸盐半乳糖体（Witvrouw等1994）；,12,热带红藻Ochtodes secundiramea含有的多种卤化类萜化合物（Maliakal等2001），可以通过月桂烯合成酶（Wise等2002）和海洋溴过氧化物酶（Roner等2001）产生。另外，从海藻组织培养中还可以生产有用的药物或其他活性物质如胡萝卜素、红藻色素等。,13,四、海藻组织培养操作,基本步骤：实验室消毒 实验室器具洗涤与消毒培养基配制与消毒外植体准备与消毒外植体切割与接种外植体培养与观察,14,1、培养基的
6、配制,高等植物培养基主要有：MS培养基（Murashige和Skoog,1962）ER培养基（Eriksson,1965）B5培养基（Gambor等，1968）SH培养基（Shenk和Hildebrandt，1972）HE培养基（Heller，1953）,15,海藻组织培养培养基（海水加富型培养基）主要有：培养褐藻的PESI培养基；培养红藻和绿藻的PES培养基、MES培养基、VAS培养基；培养一般海藻的Erd（-shreiher）培养基和ESS培养基。,16,17,人工海水培养基 这种培养基，在对海藻营养要求进行调查和调整及生理生化过程的研究时采用，适用于海藻的一般性无菌培养，主要有：绿藻常用
7、Asp1培养基、Asp7培养基；红藻常用Asp2培养基、Asp6培养基；褐藻常用Asp12培养基；绿藻常用KDX培养基。,18,19,MES培养基配制步骤：,MP II原液的配制,MES enrichment 原液的配制,20,MES培养液的配制 1000mL MES培养液=20mL MES enrichment 原液+980mL 消毒海水 熔化琼脂 电炉加热至琼脂熔化，将配制好的混合培养液加入到琼脂中，定容。调pH 正常海水的pH值一般为。用1mol/L NaOH溶液调pH 培养基的分装 用锥形瓶分装，培养基的量约为锥形瓶容量的1/51/4，用2块硫酸纸中间夹1层牛皮纸封盖瓶口，并用线绳捆扎
8、，贴标签，待消毒。,21,2、外植体的选择与消毒,外植体选择:外植体（explant）是指用于离体培养的活的植物组织、器官等材料。外植体的来源：,生长在自然环境下野生或栽培的海藻,22,最适于用作组织培养的外植体是靠近藻体生长部的分生组织，健康无毒。组织部位、植株年龄、取材季节以及植株的生理状态和质量都对培养时器官的分化有一定影响。,23,外植体消毒:消毒的尺度是既能全都杀灭外植体上附带的微生物，而又不伤害植物材料的生活力。一般使用消毒海水反复清洗进行藻体消毒，或者用碘化钾或次氯酸钠溶液进行藻体表面消毒。海藻组织培养只能做到少菌而不能真正做到无菌。,24,表1 常用消毒剂的使用和效果（引自潘瑞
9、炽，2001）,*质量分数,25,如果海藻外植体确实需要无菌，可以使用抗生素消毒，但成功率不高。使用一定浓度的抗生素浸泡一定时间，每隔一定时间挑出外植体进行无菌检测，直到确实无菌为止。培养基中应该含有300ug/mL的青霉素 G（Penicillin G）、100ug/mL的硫酸链霉素（Streptomycin sulphate）、50ug/mL的新霉素B（Neomycin B）、200ug/mL的康纳徽素（Kanamycin）,26,3、外植体切割与接种,切割:海藻多是顶端生长，切取外植体时要注意选取具有分生组织的部位，同时要注意切取藻体的大小。外植体的组织块大小：不同海藻用于组织培养的最佳
10、长度和大小是不同的。如，江蓠组织培养切段至少要在3mm以上；多管藻只含1个细胞长度的切段也能再生；不了解藻体再生能力，可以设立不同长度和大小的梯度试验，以找到组织培养的最佳藻体长度和大小。,27,切割一般在培养皿上进行 培养皿内消毒前放入3-4层圆形滤纸，在滤纸上进行切割。每切割1次外植体需要更换位点，同时器具需要用酒精灯火焰消毒1次，以免交叉感染。,28,接种:,接种就是将消毒过的外植体接入液体培养基中或插入固体培养基中，要无菌操作。接种量：固体培养基 每瓶接种4-10个外植体切段 液体培养基 接种量为液体培养基重量的 5-20%左右,29,接种基本步骤：将外植体在培养皿滤纸上切割好 用经过
11、消毒的镊子将外植体接入已消毒的培养液中。如果为固体培养基则需将外植体插入到培养基表层中，约1/2露在培养基表面外；接种后试管用无菌药棉封口，培养瓶、培养皿用无菌胶带封口；将接种后的培养瓶或培养皿放置在培养室或培养箱中培养。,30,4、海藻组织培养方法,培养方式:分固体培养基培养和液体培养基培养两种方式。一般的小型实验，可使用各种型号的培养皿或培养瓶进行液体培养基培养。如果实验材料比较多，常采用液体培养基悬浮培养法。,31,培养条件:光照条件：一般采用日光灯，光照强度范围为15-40molm-2s-1，光照时间为每日12-16 h。温度条件：根据培养材料在自然生态下的温度变化来调整培养室的温度高
12、低，一般在15-25左右。湿度条件：包括培养容器内的湿度条件和培养环境的湿度条件。,32,充气条件：液体培养可以通过充气方式进行搅拌培养。通入空气，需要经过过滤装置（滤膜孔径为0.22um）以保证无菌状态；或者用硫酸铜溶液除去杂藻以达到无污染。,33,培养液更换：可以根据培养对象和培养要求更换全部培养液或只更换1/2或1/3的培养液。注意：海水培养液因蒸发而使盐度提高，故应每天定量补加蒸馏水。,34,培养物的检查与观察:定期检查培养物细胞的分裂、生长、分化情况检查的方法：首先，用肉眼观察培养物的颜色、形状变化；其次，在倒置显微镜下或解剖镜下观察培养物细胞的生长、分化情况。必要时还可取样做细胞学
13、、染色体研究，同时做好观察记录。,35,第四节 海藻切段再生,海藻切段再生是海藻组织培养最简单的形式，就是将藻体切成段，通过无菌培养使切段再生成为植株。大型海藻是一类低等植物，其藻体再生能力比高等植物更强。,36,一、海带假根、柄、叶片切段再生,Saga等（1977）用海带藻体分别进行假根、茎、叶片切段再生试验 结果证明：只有在离基部（包括假根、柄）一段才有再生能力。,37,按下图的方法将藻体切成6段培养条件为：温度10；光照周期为10L：14D；光照强度30molm-2s-1；用PESI培养液培养。,38,2叶片+茎,3茎+固着器,4茎,5固着器,1叶片+茎+固着器,6包括生长部的叶片,1个
14、月后，叶状体上部和中部都死亡，其他结果：切段1从生长部伸长出叶片；切段2叶状体生长了约2cm，在茎的切口处从周围生出约0.5cm固着器，长成为全长约3cm的藻体。切段3从茎的切口处周围生长出约1cm的固着器，但没有再生出叶状体；切段4从茎的上下切口处周围再生出固着器约0.2cm长；切段5有固着器切口处再生出1cm长的固着器；切段6向四周生长，再生成0.7cm不定形叶状部。对照组完整的藻体全长再生长了2cm。,39,以上结果证明：,不含生长部的叶状体不能生存；虽然含有生长部的叶状部可以生长，但不能再生其他器官；柄部能够再生分化成固着器，但不能分化成叶；固着器可以再生，但只能再生成固着器。说明只有
15、含有生长部和柄的切段才能再生成为完整的植株。,40,二、茎段切段再生,Chen和Taylor（1978）用角叉菜雌配子藻体的分枝（直径大于2mm）为材料，进行了髓部组织培养试验：用靠近顶端约3cm处的藻体切段，应用含有抗菌素的海水固体培养基（SWMD-1）培养，获得无菌材料；在无菌操作下将靠近顶端的部分进行切段，并切去表皮及皮层，仅剩有内皮层和髓部小块（大小约2mm3）；再按每瓶1块组织接入50mL TC-1培养液，以200r/m的旋转速度摇床培养，培养条件为温度15，光照强度100molm-2s-1、光照周期16L:8D。实验证明内皮层和髓部细胞具有较强的再生能力。,41,脱分化：已经分化的
16、植物细胞切割损伤后,在适宜的培养基上可以诱导形成失去分化状态的比较均一的愈伤组织，这一过程称为脱分化。,第五节 海藻愈伤组织培养,42,一、愈伤组织的诱导形成,从一块外植体或单个细胞形成愈伤组织大致要经过3个时期：1、起动期 是指细胞准备进行分裂的时期。用于接种的外植体的细胞，通常都是成熟细胞，处在静止状态。起动期是通过一些刺激因素(如机械损伤、改变光照强度、增加氧等)和激素的诱导作用，使外植体细胞的合成代谢活动加强，迅速进行蛋白质和核酸的合成。,43,生长物质常用作诱导剂，高等植物的常用诱导剂有2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）、萘乙酸（NAA）和细胞分裂素等，其作用是使细胞立即进入DNA复
17、制以及全部细胞进入S期（DNA合成期）并发生同步分裂。海藻的诱导期比较短，其对诱导剂也不十分敏感。,44,2、分裂期 是指外植体细胞经过诱导以后脱分化，不断分裂、增生子细胞的过程。外植体外层细胞开始细胞分裂，使细胞脱分化，形成薄壁分生组织。如果对这一期细胞不断更换新鲜的培养基，则愈伤组织可以无限制地进行分裂而维持不分化状态。有些海藻外植体脱分化比较容易，有些比较难；不同器官、不同部位外植体脱分化差异较大，幼嫩组织较易，而成熟组织和老化组织较难。处于分裂期的愈伤组织的特点是：细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明。,45,3、形成期 分裂期后，细胞内部开始发生一系列的形态和生理变化，导致分化出形态和
18、功能不同的细胞。一般愈伤组织的颜色是浅色、透明、有光泽，老化或污染后就变为褐色或深色，直到死亡。,46,二、影响愈伤组织生长分化的因素,由处于脱分化状态的愈伤组织再度分化形成不同类型细胞的过程称为再分化。1、影响愈伤组织生长分化的内在因素 外植体遗传型 器官和部位 年龄 一般选择较幼嫩的藻体或近顶端切段作为外植体,47,2、影响愈伤组织生长分化的外部因素培养基 培养基中的无机营养元素和有机成分，特别是生长素和激动素等生长物质及其比例更起着重要作用；培养基的固体、半固体或液体状态，对愈伤组织培养也有很大影响。,48,培养条件 主要是温度、光照强度、光照周期、光质以及振动频率、通气量等。温度控制在
19、1025之间，光源可采用日光灯或自然光线，每天光照约16h，光照强度为1540 molm-2s-1。蓝光有利于芽的分化；而红光、远红外光对芽的分化有抑制作用，但促进根的分化；紫光对生芽有刺激作用。,49,激素一般来说，细胞分裂素有利于愈伤组织诱导形成；高比例的细胞分裂素/生长素的培养基易于形成芽；高比例的生长素/细胞分裂素的培养基易于形成根；由于分化与激素的关系同植物的遗传性有着密切的关系，有时会出现相反的结果。,50,三、海藻组织块愈伤组织的诱导,大型海藻如海带目中的某些种类具有较大和较厚的叶状体，可以用打孔器穿透叶状体而得到藻体组织的圆片。以此为外植体，可以获得无菌的培养物并可诱导形成愈伤
20、组织和再分化形成叶状体。现以狭叶海带(Laminaria angustata)的孢子体为例介绍这一方法。,51,1仪器 培养箱，超净台，显微镜，打孔器(直径3-5mm）数个，手术刀1把，三角瓶(100 mL)10个，酒精灯1个，其他小器具。,52,2材料准备 一般选用自然生长和人工培养的幼苗的生长部为材料。可以从海边采集海带目海藻为材料(或其他大型海藻)。采集时，将藻体和固着器一起采回，将藻体表面的附着生物洗刷干净，将茎部和叶状体下部生长点部位留下，其余部位切除弃之。用灭菌海水对留下的藻体部分反复冲洗，备用。,53,3培养基 狭叶海带采用ASP12NTA培养基(ASP12NTA的组成是每100
21、mL ASP12培养基中加10 mg三醋酸腈)，其他种材料用PESI或ASP6培养基。,54,4方法(1)将已洗净的藻体茎状部切成5cm长的组织块。(2)将茎状部切块的两端在70酒精中浸泡一会，取出后在酒精灯上将残余酒精烧掉。(3)用灭菌打孔器(直径约3mm)纵向穿透茎状部组织块，将打下的组织块切成2mm厚的小块。,55,海藻外植体切取示意图,56,(4)将几个这样的碟形小组织块置于装有50 mL ASP12-NTA琼脂培养基的三角瓶中。把三角瓶移入培养箱中(温度14、光强20003000 lx、光暗周期14：10)，培养1个月后，愈伤组织形成。,57,将切割好的外植体进行培养，可以先用固体培
22、养基，待愈伤组织形成后再转移到液体培养基中培养。培养愈伤组织和保存无性系多用固体培养基，而扩大培养和使愈伤组织分化则用液体培养基。一般的培养基（不添加激素）可以诱导形成愈伤组织，如江蓠；有的海藻需要在培养基中添加生长素进行诱导，如角叉菜培养于TC-5固体培养基中，其中含有1umol/L激动素、1umol/L NAA和2umol/L IAA。,58,海带目其他种类运用此法也可获得愈伤组织，但外观明显不同。如巨藻(Macrocysis)形成的愈伤组织可以不断增大，但不能分化形成叶状体；而海带Laminaria japonica和昆布Ecklonia cava的愈伤组织可以分化形成孢子体，其他海带如Laminaria digitata和L.hyporborea等则可由愈伤组织形成具有配子体结构的微小个体。如果需要培养成株时，可以改用分化培养基和改变培养条件。,
