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1、第七章 发酵产物的分离和精制,第一节 概述第二节 发酵液的预处理和固液分离第三节 菌体的破碎第四节 纯化第五节 成品加工,第一节 概述,发酵产物的分离和精制可称为发酵液后处理、下游加工过程（downstream processing）：对于由微生物菌体发酵的、动植物细胞组织培养的、酶反应等各种生物工业生产过程获得的生物原料，经提取分离、加工并精制目的成分，最终使其成为产品的技术。,1.发酵液的特点,含水多，产物含量低；含菌体蛋白；溶有原来培养基成分；相当多的副产物和色素；易被杂菌污染或使产物进一步分解；易起泡，粘性物质多。,对基因工程产品还应注意生物安全（biosafety）问题，要防止菌体扩
2、散，一般要求在密封的环境下操作。,2.下游加工过程的四个原则,时间短；温度低；pH适中（选择在生物物质的温度范围内）；严格清洗消毒（包括厂房、设备及管路，注意死角），这和传统产品抗生素的生产是一致的。,3.下游加工过程的一般流程,下游加工过程的四个方面：培养液（发酵液）的预处理和固液分离；初步纯化（提取）；高度纯化（精制）；成品加工。,下游加工过程的一般流程,产品的收得率和质量控制。,下游工艺过程决定于产品的性质和要求达到的纯度，如产品为菌体本身，则工艺比较简单，只需经过滤、得到菌体，再经干燥就可，如单细胞蛋白的生产。如可以从发酵液直接提取，则可省去固液分离步骤。如为胞外产物则可省去细胞破碎步
3、骤。,4.单元操作,过滤、离心固液分离；蒸发、蒸馏、结晶进一步纯化；萃取浓缩或提取液相中的成分；离子交换、层析、膜技术、超滤；干燥,第二节 发酵液的预处理和固液分离,目的不仅在于分离细胞、菌体和其它悬浮颗粒（细胞碎片、核酸和蛋白质的沉淀物），还希望除去部分可溶性杂质和改变滤液的性质，以利于后继各步操作。,在酸性溶液中，蛋白质与一些阴离子，如三氯乙酸盐、水杨酸盐、钨酸盐、苦味酸盐、鞣酸盐、过氯酸盐等形成沉淀；在碱性溶液中，蛋白质与一些阳离子，如Ag+、Cu+、Zn+、Fe+和Pb+等形成沉淀。,一、发酵液预处理,（一）菌丝体及蛋白质的处理等电点沉淀热处理变性化学变性加各种沉淀剂沉淀加入凝聚剂加入
4、絮凝剂吸附,常用凝聚剂，使胶体不稳定：硫酸铝 Al2(SO4)318H2O（明矾）；氯化铝 AlCl36H2O;三氯化铁 FeCl3;硫酸亚铁 FeSO47H2O；石灰；ZnSO4；MgCO3,工业上使用的絮凝剂，通过静电引力、范德华引力或氢键的作用，强烈地吸附在胶粒的表面，形成了较大的絮团。1）有机高分子聚合物，如聚丙烯酰胺类衍生物、聚苯乙烯类衍生物2）无机高分子聚合物，如聚合铝盐、聚合铁盐等3）天然有机高分子絮凝剂，如聚糖类胶粘物、海藻酸钠、明胶、骨胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖等。,（二）多糖如用淀粉酶酶解不溶性多糖，降低发酵液粘度，提高滤速。,（三）高价金属离子的去除离子交换法沉淀法Ca2+
5、草酸、草酸钠，形成草酸钙沉淀（注意回收草酸）；Mg2+三聚磷酸钠，形成三聚磷酸钠镁可溶性络合物；Fe2+黄血盐，普鲁士兰沉淀,二、发酵液的固液分离,重力沉降浮选通气，产生气泡，使固体附着在气泡表面除去。用于固液比重差小、直径530m颗粒的分离，污水处理旋液分离旋风分离器介质过滤离心,霉菌和放线菌为丝状菌，体形较大，发酵液采用过滤方法；细菌和酵母菌为单细胞，体形较小，其发酵液采用高速离心分离，如对发酵液进行预处理，也可用过滤进行固液分离。,板框过滤机 广泛应用于培养基制备的过滤及霉菌、放线菌、酵母菌和细菌等多种发酵液的固液分离。适合于固体含量1-10%的悬浮液的分离。优点：结构简单，装配紧凑，过
6、滤面积大；能耐受较高的压力差，能适应不同过滤特性的发酵液的过滤；辅助设备少、维修方便、价格低、动耗少等。缺点：设备笨重、间歇操作、劳动强度大、卫生条件差、辅助时间多、生产效率低。,第三节 菌体的破碎,为了研究细胞的破碎，提高其破碎率，有必要了解各种微生物细胞壁的组成和结构？,细菌破碎的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构，网状结构越致密，破碎的难度越大，革兰氏阴性细菌网状结构不及革兰氏阳性细菌的坚固；酵母细胞壁破碎的阻力也主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度；由于霉菌细胞壁中含有几丁质或纤维素的纤维状结构，其强度比细菌和酵母菌的细胞壁有所提高。,1、高压匀浆机有一个或数个往复运动的柱塞，物料在柱
7、塞作用下进入可调节压力大小的阀组中，经过特定宽度的限流缝隙（工作区）后，瞬间失压的物料以极高的流速（1000-1500米/秒）喷出，碰撞在碰撞阀组件之一的冲击环上，产生三种效应：空穴效应、撞击效应、剪切效应。经过这三种效应处理过后，物料粒径可均匀细化到100nm以下，破碎率大于95%。主要应用：*大肠杆菌细胞破碎*酵母等真菌破碎*曲霉等厚壁菌破碎*藻类等单细胞破碎,2、超声破碎法（Ultrasonication）在15-25 kHz的频率下操作。其原理可能与空化现象（cavitation phenomena）引起的冲击波和剪切作用有关。空穴泡由于受到超声波的迅速冲击而闭合，从而产生一个极为强烈
8、的冲击波压力，由它引起的粘滞性旋涡在介质中的悬浮细胞上造成了剪切应力，促使细胞液体发生流动，从而使细胞破碎。一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌比G+细菌易破碎，对酵母菌的效果较差，在实验室小规模细胞破碎中常用。,3、酶解法（1）外加酶法常用的溶酶有溶菌酶、-1，3-葡聚糖酶、-1，6-葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶、肽键内切酶、壳多糖酶等，而细胞壁溶解酶是几种酶的复合物。溶菌酶主要用于细菌类，利用溶酶系统处理细胞时必须根据细胞壁的结构和化学组成选择适当的酶，并确定相应的次序。如对酵母细胞采用酶法破碎时，先加入蛋白酶作用蛋白质-甘露聚糖结构，使二者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖层，最后只剩
9、下原生质体，这时若缓冲液的渗透压变化，则细胞膜破裂，释出胞内产物。优点：选择性释放产物，条件温和，核酸泄出量少，细胞外形完整。缺点：溶酶价格高，溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同的酶），产物抑制的存在，在溶酶系统中，甘露糖对蛋白酶有抑制作用，葡聚糖抑制葡聚糖酶。（2）自溶法（Autolysis）诱发微生物产生过剩的溶胞酶或激发自身溶胞酶的活力，以达到细胞自溶的目的。影响自溶过程的主要因素有温度、时间、pH值、激活剂和细胞代谢途径等。缺点是：对不稳定的微生物，易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。,第四节 纯化,一、发酵产物的分离方法吸附法溶剂萃取法离子交换法沉淀法,吸
10、附剂：活性炭，白土，氧化铝等,青霉素，在酸性条件下成游离状态，在乙酸丁酯中溶解度较大，从水相转移到乙酸丁酯中。在中性条件下成盐，在水中溶解度较大，从乙酸丁酯转移到水中。,盐析，最常用硫酸铵加入有机溶剂使蛋白质失活调节pH值至等电点加入非离子型聚合物入PEG加入聚电解质如聚丙烯酸。,第四节 纯化,二、发酵产物的各种纯化方法层析分离中间盐转移法结晶和重结晶法活性炭脱色法和超滤法加抗氧化剂或通入惰性气体加脱水剂透析法电透析法浓缩法,1）新型分离介质的研究开发2）子代分离技术3）其他新兴下游技术,膜（膜材料和膜制造工艺）、树脂（离子交换树脂和大网格树脂）和凝胶（琼脂糖凝胶为基质，与各种配基结合后制成各
11、种色谱分离介质）是目前主要的新型分离介质。,各种分离纯化技术相互结合、交叉、渗透，形成子代分离技术。如膜技术和萃取、蒸馏、蒸发技术相结合形成了膜萃取技术、膜蒸馏及渗透蒸发技术；色谱技术与离子交换技术等结合形成了离子交换色谱、等电聚焦色谱等。,由溶剂萃取技术衍生出一大批生物工业分离技术，如双水相萃取、超临界CO2萃取、反胶团萃取（细胞碎片去除、细胞胞内物质、酶及蛋白质、天然生物物质的提取分离）；菌体絮凝技术和菌体细胞破碎技术的进展为工业化经济地分离菌体细胞和大规模生产胞内物质创造了技术前提。,下游技术的发展动态成本、质量、环保将是该技术发展方向和动力,Ultipor N66 膜式过滤器是顺尔公司
12、七十年代未开发成功的产品，它采用天然亲水性尼龙66（N66）滤膜，化学兼容性广，强度大，韧性好，易于湿润进行完整性检测。使用条件：蒸汽消毒一般用滤芯：125，16小时：140，4小时，溶剂用滤芯：125，50小时：140，10小时，典型应用：医药用水，培养基，诊断试剂，药用溶剂针剂，大输液，抗生素溶液等,第五节 成品加工,干燥采用汽化的方法以除去物料中的水分（或溶剂）的操作过程。主要目的：提高药物或药剂的稳定性；有利于保存与运输使药品达到标准；便于进一步处理。主要方法：减压干燥、喷雾干燥、气流干燥、冷冻干燥等,喷雾干燥,利用喷雾器，将浓缩液或悬浮液喷成雾滴，形成具有较大表面积的分散微粒，同热空气发生强烈的热交换，迅速排除本身的水分，在几秒至几十秒内获得干燥。成品以粉末状态沉降于干燥室底部，连续或间断从卸料器排出。优点：适用于热敏性物质的干燥，如抗生素等省去蒸发、结晶、分离和粉碎等工序缺点：用量大、处理量小、收率低,本章要点,发酵下游处理的一般流程发酵液预处理的目的和方法常用固液分离方法发酵产物精制的常用单元操作,
