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1、固定液的种类和常用固定液的配方固定液的种类分为两大类：简单固定液和混合固定液。1.简单固定液又称单纯固定液 就是用一种化学试剂作为固定液。种类有：乙醇、福尔马林、醋酸、苦味酸、铬酸、重铬酸钾、升汞和锇酸等八种。2.混合固定液 就是用几种化学药品，按一定的比例混合配制而成的，由于各种药品的优缺点互相弥补，因此可产生较好的效果。,常用固定液的配方（1）福尔马林Formalin，3740的甲醛(HCHO)适合固定的浓度：10福尔马林(3.74甲醛)（2）卡诺氏液(Carnoys Fluid)适用范围：适用于胚胎学、细胞学研究。配方：(1)纯酒精 3份 冰醋酸 1份(2)纯酒精 6份 冰醋酸 1份 氯
2、 仿 3份,卡诺氏液的处理方法和特点 处理：固定时间为1224小时，也可缩短。根尖可固定15分钟。花药固定1小时，子房可固定1224小时。固定完毕可用95或纯酒精洗涤，换二次，经二甲苯与纯酒精等量混合液过渡，二甲苯透明两次，就可进入石蜡中浸蜡。如果不立即制片时，可转入70%酒精中保存。特点：固定液穿透力既强又快，纯酒精固定细胞质，冰醋酸固定染色质，并能防止组织由酒精引起的高度收缩与硬化。,（3）福尔马林醋酸酒精混合液(FAA)适用范围：适用于植物各器官解剖结构的观察，但不适于染色体观察研究。配方：50或70酒精 90毫升 冰醋酸 5毫升 福尔马林 5毫升 处理：1、一般柔软材料，可用50酒精。
3、2、固定时间最短需18小时，也可无限期延长。3、冲洗时材料可直接换入50或70酒精中洗一、二次，木质材料在流水中冲洗48小时，并在酒精(50)和甘油溶液(1：1)中浸2、3天，使它软化。,（4）纳瓦兴氏液(Navaschins Fluid)适用范围：植物组织及细胞学的研究 配方：甲液：10铬酸 15毫升 冰醋酸 10毫升 蒸馏水 75毫升 乙液：福尔马林 40毫升 蒸馏水 60毫升 在使用之前，才将甲、乙两液等量混合。材料经固定之后可在此液中长期保存。处理：固定时间为24-48小时，固定后可直接在蒸馏水中洗几次，再继续脱水。,冲洗目的 材料自固定液中取出后，须立即冲洗，使其中含有的固定液全部除
4、去，直到洗净为止，否则防碍染色和保存。冲洗液的选择 冲洗液应依固定液的性质而定，一般水溶性的固定剂用水来冲洗，酒精溶性的固定剂用相同浓度的酒精冲洗。冲洗的方法 1、水冲洗法 2、酒精洗涤法,脱水脱水的目的 目的：除去组织中的水分，使组织变硬。原因：水和石蜡是不溶的，经过脱水剂将水分脱净，透明剂透明后，才能进入包埋阶段。脱水不干净，影响制片效果，甚至完全失败。脱水剂及其脱水方法 脱水剂 最常用的脱水剂为酒精。此外还有丙酮、正丁醇和叔丁醇等。,脱水方法 1.配制下列各级浓度的酒精：15，35，50，70，85，95，100。2.一般经水洗的材料，脱水可自35开始，柔弱的材料自15开始，若用酒精洗涤
5、，则可直接移入50或70酒精中继续脱水。3.在每级中停留的时间，依材料的大小、性质以及留在固定液中的时间长短和固定液的溶解性而定。一股的标准是：(1)如洋葱、蚕豆等根尖和小片叶子一样大小的材料，每级停留约30分钟到1小时。,(2)由FAA固定的草本茎，每级停留2小时，木本茎停4小时，较大的木材每级应延长为812小时。(3)脱水至纯酒精时，需更换二次，每次30分钟到1小时；材料大者，可多换一次。由95换100酒精时，瓶子上的塞子也应更换干燥的，以免有水分渗入。(4)已制成的切片，在染色缸中脱水时，每级停留时间约为310分钟。(5)脱水时应按顺序进行，级度不宜相差太大，一般应按第1项所配各级浓度进
6、行。,透明透明的目的 主要目的：1、替代组织中的酒精或丙酮，使石蜡能很顺利的进入组织中。2、增强组织的折光系数。3、能和封藏剂混合进行封藏。透明剂的特性 必须具有既能与脱水剂相溶又能与包埋剂相溶的特性。透明剂的种类 常用的明透剂有二甲苯、甲苯、苯、氯仿、香柏油和苯胺油等，二甲苯为最常用的透明剂。,透明的方法 为了避免组织收缩，在纯酒精或丙酮脱水以后，必须经过几个级度，逐渐置换，最后移入二甲苯中。酒精与二甲苯混合的比例列表如下：,在透明时应注意的问题 1.如材料内仍留有微量水分，二甲苯就进不去，因此石蜡也不能透入，切片后将在蜡片上出现空洞。2.切片内留有微量水分，在封藏以后，就会发生乳白色的云雾
7、状，在显微镜下观察时，可见许多密集水珠把组织掩盖，影响观察。3.二甲苯极易挥发，故在切片透明之后，从染色缸中取出封藏，手续要敏捷，不宜久置，否则待二甲苯挥发干净后，组织就变硬发白。,4.二甲苯极易吸收空气中的水分，故在湿度大的天气，贮有二甲苯的染色缸的盖子周缘可涂少许凡士林，以防止水分的渗入。在封片时也不宜将口鼻过分靠近切片，以免水气侵入，出现白色云雾状。5.二甲苯必须保持无水、无酸。若用一、二滴石蜡油滴入其中，立即出现云雾状，即表示其中已含有水分，不能再用。,浸蜡 将石蜡浸入整个组织的过程称为浸蜡。包埋剂 包埋所用的各种石蜡，其熔点约在5060之间。石蜡的选择方法 1.依所包埋的材料不同而异
8、，软的材料用软石蜡，硬的材料用硬石蜡。一般动物材料最常用的石蜡熔点为5256，植物材料用的石蜡熔点为5458。,2.如果需要切很薄的片子(4微米以下)，可用熔点5860的石蜡，较厚的则用熔点5254的。3.根据当地当时的气候条件，夏天气温高时，通常用5658的蜡，冬天气温低时用5456的蜡。,石蜡,性质好的石蜡，必须具备的条件(1)熔点已知。(2)结构细致，光滑而均匀。(3)无灰尘、水分及挥发性物质等。鉴定石蜡品质优劣的方法 可先将石蜡熔化，倒入纸匣中凝成蜡块，如品质优良，则具备下列特点：(1)无气泡，无不透明的点子和裂痕。(2)蜡块断裂后，其断裂面不呈颗粒状。(3)如果将它切成薄片，不会碎成
9、细粒。,石蜡的清净方法 1.将石蜡放入锅中加热到开始冒白烟后为止，使其中的水分及挥发性杂质逐渐被蒸发掉。2.热过的石蜡放在温暖处慢慢冷却，这样就可使其中的灰尘等杂质颗粒沉下去。3.待石蜡的表面已凝为固体时，即可慢慢地将上面的石蜡倒在纸匣或其它容器中，把下面沉淀的杂质留下来。,浸蜡方法(1)将组织留在透明剂中，在透明剂上轻轻倒上一层已熔化的石蜡，其分量比例约为3：2。(2)倒入的石蜡即凝成固体，然后将材料放在3537之间的熔蜡炉内，经一、二天到石蜡不再继续熔化时为止。(3)将材料移入5660 的恒温箱中停留25小时，待石蜡融化后换纯蜡。(4)换二、三次新鲜纯石蜡，使留在组织内的透明剂全部排除后即
10、可包埋。,浸蜡过程应注意的问题 1.尽量保持在较低温度中，以石蜡不凝固为度。2.力求在最短时间内完成石蜡的浸透过程。因为温度过高或时间过长都会引起组织变硬、变脆、收缩等，影响制片效果。,包埋 被石蜡浸透的组织连同熔化的石蜡，一起倒入纸盒内，并投入冷水中，使它立刻凝固成蜡块的过程。包埋前的准备工作 1.摺包埋用的纸盒并写好标签。2.检查恒温箱中所熔的新鲜石蜡是否够用。,纸合的折叠方法,3.在脸盆内放入冷水备用。4.点燃酒精灯，准备好1把镊子，1支拨针。包埋的操作过程 1、右手持镊子，左手从恒温箱中取出盛满熔化石蜡的小瓶，并随手将恒温箱的门关闭，立即将小瓶中的石蜡和材料一起倒入包埋用的纸盒中，如果
11、纸盒中蜡的量少，可再加入适量的蜡。2、材料倒入纸盒后，将镊子在酒精灯上烧热，将材料分开，使材料之间保持一定的距离，并注意材料的方向。,3、将拨针烧热，沿着纸盒的边缘以及材料的周围轻轻移动，目的是将蜡中的气泡赶走和使蜡凝固时较均匀。4、将标签插入纸盒的边缘，并将有字的一端露在外面。5、轻轻将纸盒平放在脸盆的水面上，待纸盒内石蜡的表面已凝固，即可将纸盒沉入水中，使包埋块迅速冷却。6、纸盒在水中经30分钟到1小时后即可取出，将纸盒打开取出包埋的蜡块备用。,包埋中出现的问题及其解决办法问题 包埋后的石蜡块应为均匀的半透明状态，但有时出现白色混浊的结晶部分，这样在切片时就有妨碍。原因 1.脱水不干净。2
12、.组织内部或石蜡中混有透明剂。3.石蜡本身品质不良。4.纸盒中周围的石蜡先成凝固状态，中部的石蜡凝固较晚。5.石蜡冷凝得太慢。解决办法 属于前三个原因者，应在包埋之前就须注意。属于后二个原因者，应将包埋块再投入纯蜡中熔化后重新包埋。,切片蜡块的分割、整修与固着1.选取所要切片的材料，用单面刀片从包埋的石蜡块上切割下来，注意不可损伤所包埋的组织。2.确定切面的方位，用刀片将石蜡的四面作初步的整修。3.取一块台木，用镊子夹取少量的碎蜡放于台木上，后点燃酒精灯，烧热镊子将台木上的石蜡熔化，迅速将蜡块粘在台木上。4.再用镊子夹取少许碎蜡放在蜡块四周，后在酒精灯上将镊子烧热，迅速将蜡块四周的碎蜡熔化烫平
13、，使石蜡块牢固地粘在台木上。,蜡块切修,将蜡块粘在台木上,整修蜡块时，应注意的问题 1.应将蜡块的前后、左右四个面，两两修成平行的面，这样切成的蜡带就成直线，如果两面不平行，切成的蜡带将弯曲。2.将蜡块四周多余的蜡修掉，但注意不要太靠近组织，特别是不要将组织露在外面。,切片 1.将粘有蜡块的台木装在切片机的装物部位上。2.检查刀口是否锋利，是否有缺口。3.调整刀片的角度，一般以58为宜。4.蜡块切取面和刀口必须平行，并使刀口恰好邻近蜡面，切忌蜡块超过刀口。5.调节切片厚度，一般石蜡切片厚度为810微米。6.切片时用力要均匀，速度要适宜。到蜡带长度达到2030cm时，可用毛笔挑起放于白纸上备用。,切片,切片过程中常见现象分析1、蜡片卷曲，主要由于：a切片刀不锋利 b切片刀的角度不正确 c切片太薄或太厚 d石蜡太软或太硬(与温度有关)e蜡块中的材料不在中央2、材料与蜡片分离 石蜡温度与材料温度不一致。3、蜡片上有条纹，是因为切片刀上有缺刻。4、蜡带不成直线，是因为蜡块上下不平整。5、蜡片破碎不成蜡带而吸附于切片刀上，由于材料过脆与切口摩擦产生静电的原因。,
