《编免疫组化》PPT课件.ppt

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1、免疫细胞（组织）化学技术病理教研室金晓明,主要讲述内容：第一部分 免疫细胞化学的理论基础第二部分 免疫荧光细胞化学技术第三部分 免疫酶细胞化学技术第四部分 免疫电子显微镜技术,第一部分 免疫细胞化学的理论基础 免疫细胞化学是免疫学与细胞化学相结合的一个分支学科，以免疫学的抗原抗体反应为其理论基础。,第一节 抗原（antigen）一、抗原的概念 是一类在合适的条件下，能激发机体免疫系统发生免疫应答，并能与免疫应答产生的效应物质在体内和/或体外发生特异性结合反应的物质。抗原的性能：免疫原性 产生免疫应答 反应原性 产生特异性反应,二、抗原决定簇 是与相应抗体或淋巴细胞抗原识别受体相结合的部位，是决

2、定和控制抗原特异性的特殊化学基团。类型：功能性抗原决定簇 隐蔽性抗原决定簇 免疫优势决定簇 线性或连续性决定簇 构象决定簇或不连续性决定簇B 细胞所识别的是半抗原决定簇；T细胞所识别的是免疫原性决定簇或连续性决定簇。,三、抗原的性质与种类（一）抗原的性质1、抗原的异物性 机体能对进入体内的异种、异体的大分子物质产生免疫应答。该物质与机体的种系关系愈远，其免疫原性愈强，机体的免疫反应也更强。自身抗原；自身抗体2、大分子胶体 作为抗原，分子愈大，其免疫原性愈强 3、抗原的特异性 各种抗原物质各有其特异的抗原决定簇，即一种抗体只能与相应的抗原起反应而不能与其它抗原反应。,（二）抗原的种类方法 分类依

3、据 种类单独存在时是否有免疫原性 半抗原和完全抗原抗原来源 外源性抗原和内源性抗原抗原与宿主关系 异种抗原，同种异体抗原，自身抗原B细胞产生抗体时是否需要T细胞辅助 胸腺依赖抗原，胸腺非依赖抗原化学物质 蛋白质，多糖，脂蛋白，脂多糖，糖蛋白，核酸等物理状态 颗粒性抗原，可溶性抗原产生方式 天然抗原，人工合成抗原，基因工程抗原抗原特异性程度 特异性抗原，共同抗原,完全抗原：同时具有免疫原性和反应原性的物质。不完全抗原或半抗原：无免疫原性。,第二节 抗体（antibody）一、抗体的概念 机体受到抗原刺激后，通过体液免疫应答，B淋巴细胞活化、增殖、分化为浆细胞，由浆细胞合成并分泌的仅与该抗原发生特

4、异性反应的球蛋白。二、抗体的性质和种类（一）抗体的一般性质 免疫球蛋白约等于抗体，分五类：IgG,IgM,IgA,IgD,IgE,（二）免疫原性和分类特性 免疫球蛋白都是大分子蛋白质，具有免疫原性，课作为抗原。由于存在着轻链和重链，可变区和稳定区，因此，分子结构差异较大，免疫原性比较复杂。（三）抗体的种类1、根据抗体的途径或来源不同分为免疫抗体；天然抗体；自身抗体2、根据抗原抗体在试管内是否出现肉眼反应分为完全抗体；不完全抗体,三、抗原与抗体反应 称为免疫学反应。在体内进行称为免疫反应；在体外称为血清学反应四、抗体形成的机制（一）免疫应答的产生1、感应阶段（识别及加工处理抗原阶段）2、反应阶段

5、（淋巴细胞增殖分化阶段）3、效应阶段（发生免疫反应阶段）（二）影响抗体产生的因素1、抗原的质和量2、机体方面3、佐剂的增强免疫作用,第三节 有关基本技术方法一、抗体的制备（一）抗体的制备方法 能制备出具有很高特异性和敏感性的高效价多克隆和单克隆抗体。,1.多克隆抗体（血清抗体：指机体接受抗原主动免疫或被动免疫后从血清中分离提纯的抗体。2.单克隆抗体：是1975年由Kohlenh Milstein发明的一种新技术。其原理是将体外培养的骨髓细胞和免疫的脾细胞相融合，产生杂交细胞。这种融合的杂交细胞既有骨髓细胞的无限生长能力，又有浆细胞分泌单一抗体的能力。将该免疫细胞纯化，成为单克隆系，就能产生大量

6、专一的高纯度的抗体，即单克隆抗体（monoclonal antibody,McAb),单克隆抗体与多克隆抗体特性的比较 特性 多克隆 单克隆组成 多种类抗体的混合物 单一种类的抗体 特异性 低 高 针对多个抗原决定族 针对单一的抗原决定族亲和力 平均亲和力较高 不定，较低交叉反应 高 低,（二）抗体的配制方法1、抗体贮存2、抗体使用液的配制,二、组织材料的处理 尽量保存好抗原性不丢失、不扩散、不被破坏三、免疫染色1、增强特异性染色方法蛋白酶消化法；合适的抗体稀释度；温育时间2、减少或消除非特异性染色方法3、显色反应的控制4、复染,四、对照 阳性对照；阴性对照五、结果的判断（一）阳性细胞的染色特

7、性1、分胞浆、细胞核、细胞膜表面阳性2、灶状和弥漫性3、非特异性的认知4、切片质量不佳出现的阳性要排除（二）染色失败的几种原因,第二部分免疫荧光细胞化学技术 Coons等（1941）通过荧光标记抗体，并借助于荧光显微镜观察荧光的发光物质，而建立的该项技术。近年来，与激光技术、电子计算机、扫描电镜等技术的结合发展为定量免疫荧光技术。加之荧光激活细胞分类器的应用和激光共聚焦显微镜的问世，开创了免疫荧光技术的新领域。,第一节 原理一、基本原理 免疫荧光技术也是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检测组织或细胞内的相应抗原（或抗体）

8、。二、荧光产生的原理 分子都含有电子，电子载不断的运动着。一般情况下，电子总是处于能量最低的能级（即基态）在一定的条例下，电子可吸收能量跃迁到较高的能量级（即激发态），这个过程叫激发。,二、荧光素1、荧光色素 能够产生荧光并能作为染料的化合物称为。特性：必须具备吸收激发光的光能并发射荧光；具有吸收 一定频率光能的生色团和能产生一定光亮子的荧光 团。,2、用于标记抗体的荧光素必须具备以下条件：1）应具有与蛋白质分子形成共价键的化学基因，结合后不易解离，而未结合的色素及其降解产物容易排除。2）荧光效率高，与蛋白质结合荧光效率下降不多。3）结合抗体蛋白后对抗体的免疫学性质和生化性质无影响。4）与蛋白

9、质结合的方法简便而快速。5）荧光素容易溶解，溶解后不会与其它物质发生化学反应。6）荧光颜色与背景组织的自发荧光颜色对比鲜明，能清晰判断结果。,3、荧光素的类型1）异硫氰酸荧光素（fluorescien isothocyanate,FITC)2）四甲基异硫氰酸罗达明（tetraethyl rhodamine isothocyanate,TRITC)3）四乙基罗达明（tetraethyl rhodamine,RB200)4）其它,三、免疫荧光染色方法1、直接法：用已知特异性抗体与荧光素结合，制成特异 性荧光抗体，直接用于细胞和组织抗原的检查。优点：特异性高缺点：一种荧光 抗体只能 检测一种 抗原。

10、,2、间接法：用特异性的抗体（1抗）与细胞或组织标本反应，随后用缓冲液洗去未与抗原结合的抗体，再用间接荧光抗体（2抗）与结合再抗原上的抗体结合，形成抗原 抗体 荧光抗体的复合物。优点：荧光亮度增强，提高了敏感度,四、非特异性染色的消除方法1、非特异性染色的主要因素1）部分荧光素未与蛋白质结合，形成聚合物和衍化物而不能被透析除去。2）抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与组织成分非特异结合。3）组织内类属抗原的存在。4）从组织中难以提纯抗原性物质。5）抗体分子上标记的荧光素太多。6）荧光素不纯，标本固定不当。7）细胞和组织内某些物质自发荧光。8）染色时间过长，温度过高，冲洗不够或标

11、本干燥。,2、消除的方法1）衬染法（可抑制自发荧光）2）胰蛋白酶消化（可抑制非特异性荧光）3）吸收（用小属肝粉消除组织非特异性荧光的染色）4）用正常（非免疫）血清（清除自发荧光和非特异性荧光）5）提高抗体和荧光抗体的质量,五、荧光显微镜及检测方法略六、染色标本的保存 原则上应立即再荧光显微镜下观察，拍照，此时荧光最强。用缓冲甘油封片，保存在4中，过夜后特异性荧光强度减弱25，保存1周后减弱60。,Nikon荧光显微镜,肾活检（直接法）,肾活检（直接法）,肾活检（直接法）低倍视野,肾活检（直接法），表达弱,肾活检（直接法）,肾活检（直接法）,左图：表达在细胞核（FITC）,右图：表达在胞膜,左图

12、：DAPI 染色（染核）,右图：,胃粘膜上皮细胞，胞浆胞膜阳性,血管内弹力膜阳性,胃腺癌,第三部分免疫酶细胞化学技术 免疫酶细胞化学技术是免疫组织化学中最常见的方法之一，它是在抗原抗体特异性反应存在的前提条件下，借助于酶学细胞化学手段，检测某种物质（抗原/抗体）组织细胞内存在部位的一门新技术。,第一节 免疫组织化学的基本技术一、取材1.实验动物 麻醉（处死），锋利刀片切成大小适中，厚度3mm4mm。小型实验动物：灌注（流）固定后取材（生理盐水和4多聚甲醛）2.人体材料 活检组织、手术标本、细胞和组织,二、固定 原则是保持组织形态良好和被检测抗原的前提下，应采用浓度最低的固定剂和最短的固定时间，

13、固定时间一般为112h。1.常用的固定剂（1）甲醛缓冲液 广泛应用于病理标本的固定，甲醛在很好地保护组织形态结构完整的同时也有效地保存某些抗原。由于甲醛的交联作用会影响被固定细胞膜的通透性不利于染色时抗体的渗透，因此染色前常用酶进行消化以使抗原决定簇充分暴露，固定时间不直超过24h。,（2）4多聚甲醛磷酸缓冲液 广泛应用于光镜细胞化学研究。（3）戊二醛多聚甲醛缓冲液 适用于光镜、电镜免疫组织化学研究。（4）其它 如PLP液（过碘酸赖AA多聚甲醛固定液）、丙酮及醇 类、锇酸等。,2.固定注意事项（1）固定液的选择标准：A.组织形态结构保存良好。B.最大限度保存抗原的抗原性。（2）组织块的大小：1

14、.5cm1.5cm0.5cm为宜。（3）固定时间：与组织块大小成正比，与固定液浓度成反比。（4）温度：一般在室温下进行，电镜标本和固定时间较长时 可放置在4冰箱。（5）固定后处理：充分冲洗，除去多余固定剂。,三、包埋 1.石蜡包埋 2.冷冻包埋 3.环氧树脂包理四、切片 1.载玻片的处理（1）清洗（2）涂胶（防止脱片）。常用粘附剂：明胶：铬矾明胶和甲醛明胶。树脂胶：也称白胶。多聚赖氨酸（PLL）。商品化粘附剂。,2.切片类型（l）石蜡切片 厚约3 5m，放置37温箱烘烤过夜，以减少脱片。（2）冷冻切片：2m。（3）振动切片：特点是组织经固定后不需包埋，只要用胶水粘在载物台上即可切片。切片较厚，

15、可将阳性部位作电镜包埋。神经组织应用较多。,第二节 免疫组化染色过程中基本技术一、蛋白酶消化技术 进行固定时，抗原决定簇有可能被固定剂所封闭，因此在抗原抗体反应前，常用蛋白酶处理组织切片，使抗原决定簇充分暴露出来，并使组织的通透性增高，以利抗原抗体最大限度地结合增强特异性染色。1.常用的消化酶 胰蛋白酶、胃蛋白酶2.消化时间 因组织而异，一般为530min，消化时间不宜太长，以免损伤组织形态，破坏抗原决定族。消化结束后要充分洗涤，以除去残留的蛋白酶。,3.非特异染色的控制 非特异染色或背景染色是指在免疫组化染色过程中凡不属于特异性抗原抗体反应所出现的染色。（1）原因分析组织方面：主要有组织的自

16、发荧光、内源性过氧化物酶或碱 性磷酸酶、内源性生物素等.试剂方面：因抗体不纯、标记的酶和荧光不纯或标记过量等。（2）消除方法 加1抗前加正常血清1030min，以封闭组织中带电荷的基因，避免与1抗的非特异性结合。,减少非特异性染色：a.免疫酶组化染色时，在加1抗前，用0.3%的H2O2甲醇溶液将组织切片处理30min（3%的H2O2甲醇溶液处理510min）。b.免疫荧光染色时，可用0.010.05伊文思蓝稀释荧光抗体。二、对照 阳性对照片：用已知抗原为阳性的标本作对照 阴性对照片：确认不含己知抗原的标本作对照,三、抗体的分装、稀释、滴加及保存1.抗体的分装 不能用完的抗体分装在小的EP管内，

17、保存在-20-40的低温冰箱中持用可保持数年有效。2.抗体稀释 常用0.01MPBS（磷酸缓冲溶液）或BSA（牛血清白蛋白）3.滴加 滴加抗体要充分覆盖组织切片，一般加 3050L,最好在滴加前，用蜡笔或特制的组化笔在组织周围画一圈,以防溶液的扩散。4.保存 未用完的抗体可在低温冰箱或冻干保存，已稀释未用完的抗体最好在一周内用完，不宜长期保存。,四、免疫酶组织化学技术和酶标抗体技术1.免疫酶染色原理 用酶作为标记物，可分为直接法、间接法、补体法、免疫酶桥法、免疫酶双桥法、过氧化物酶抗过氧化物酶法（PAP法）和双PAP法等。（1）直接法原理：用酶直接标记在特异性1抗上，与标本中的 抗原结合，让酶

18、催化底物反应产生有色产物，沉淀在抗 原抗体反应部位，即可在镜下对标本的抗原进行检测。优点：简便、快速、特异性强；缺点：敏感性差。,（2）间接法原理：先用标记的特异性1抗与标本中相应抗原结合，再用酶标记的抗球蛋白抗体（2抗）孵育，然后再加 酶的底物，显示抗原抗体抗原抗体复合物存在的部 位，以对抗原进行检测。如：1抗是由兔产生的多克隆抗体,则2抗常用羊抗兔IgG；1抗是由鼠产生的单克隆抗体,则2抗常用羊或马抗鼠IgG。以上两种方法称为酶标抗体法（3）非酶标记的抗体酶法：是以酶为抗原免疫动物，产生抗酶的抗体。通过酶与抗体的特异性结合进行标记。该方法适用于石蜡包埋的组织切片。常用的有PAP、sABC、

19、LsAB法（附图表说明）,（酶标识特异抗体,（酶标识二次抗体,生物素,HRP,ALP,2.常用的酶种类 底物 沉淀颜色HRP A.3,3氨基联苯胺DABH2O2 深褐色 B.5氨基水杨酸 H2O2 棕色ALP A.苯酚磷酸盐重氮盐红色 B.P校际酚磷酸盐黄色酸性磷酸酶 Gomoui液葡萄糖氧化酶 D葡萄糖MTT酚嗪磷酸 甲酯化合物 蓝色,第三节 免疫组化的实际操作1.实验准备（必须器材）（1）实验台：光线充足，方便操作。（2）湿润盒：放置抗原抗体反应过程中反应，避免干燥。（3）微量移液器：120l,20200l,1001000l。（4）其它：滤纸、纱布、吸头、EP管、染缸、提篮等。2.试剂药品

20、（1）缓冲液：PBS,0.01 M磷酸缓冲液（pH7.2）TBS,0.05 M Tris盐酸缓冲液（pH7.6）（2）抗体稀释液:1BSA或0.01 MPBS（3）102抗免疫动物的正常血清（4）DBAH2O2显色液（5）核复染液：苏木素或甲基绿,3.sABC法的操作过程基本原理：sABC（strepto-avidin-biotin peroxidase complex）链球菌抗生物素（卵白蛋）生物素过氧化物酶复合物生物素(biotin):是一种分子量为244da的小分子的维生素。抗生物素(avidin):是一种糖蛋白，分子量为68KDa。生物素与抗生物素有很强的亲和力，两者一旦结合就很难解离

21、。同时生物素与抗生物素都有与其它示踪剂如荧光素，胶体金和过氧化物酶等相结合的能力。所以生物素-抗生物素系统具有灵敏度高、特异性强及方便快速等显着优点。附基本操作步骤,第四节 注意事项及结果判定 要想得到理想的结果，组织细胞形态的保存、抗原性的保存、充分的显示是非常必要的。要满足这些条件，取材、固定、切片厚度、操作过程、抗体浓度及特异性的选择、操作前蛋白酶的消化、抗原修复及显色等各程序的操作不当均可导致不满意结果的产生。,1.取材固定 标本要尽可能新鲜，取材固定要及时，固定液要新 鲜充足，防止组织破坏和抗原性的失活。2.切片 切片不宜过厚，一般4m左右。切片不宜过大，载玻片要涂粘附剂，以防脱片。

22、切好的切片暂放37温箱保存。,3.脱蜡 脱蜡一定要彻底，新鲜二甲苯 5min3。4.蛋白酶消化 由于组织在固定时抗原决定簇可能被固定剂所封闭，因此在抗原抗体反应前常用蛋白酶处理组织切片（根据1抗要求），使抗原决定簇充分暴露出来，并使组织通透性增高，使抗体充分结合抗原，增强特异性染色。一般用0.1%胰蛋白酶或胃蛋白酶消化530min。5.抗原修复 一般在柠檬酸钠抗原修复液内，微波炉，8595，10min左右。,6.抗体的选择 选择抗体时要注意是用于冰冻切片还是用于石蜡切片的抗体，或是二者均可；其次要看抗体说明，是单抗还是多抗；适用于哪些组织；抗体来源于哪种动物，由此来选择2抗；还有抗体的稀度（在

23、实验前根据预实验选择最佳浓度。7.特异性的确定 阴性对照（不加1抗，用PBS或TBS代替）阳性对照（已知确定阳性的组织）或买阳性对照片显色：注意H2O2的浓度，必须在显示前加入H2O2均匀搅拌，最佳显色时间在35min，过短或过长都不会出现满意的效果。,9.复染 一般用苏木素30s1min，过长复染将掩盖免疫组化的染色效果。10.结果判定 判断是否阳性或阴性，要排除假阳性或假阴性结果。也要学会判断特异性染色和非特异性染色。呈色深浅可反映抗原存在的数量，可作为定性、定位和定量的依据。有关阳性结果的定量判断，常规的方法是根据呈色深浅和阳性细胞数量分类计算，以（-）,+,+,+等分级和计数统计。以下

24、用图片说明,胃癌淋巴结转移cerbB-2癌基因表达sABC法,胃癌，P53抑癌基因表达，sABC法,胃癌CerbB-2的表达，sABC法,胃癌cerbB-2的淋巴管侵袭，sABC法,胃淋巴组织反应性增生，CD20/CD43检测sABC法,胃组织中的反应性增生的淋巴组织，CD43表达，sABC法,IgAN，TGFs2表达，主要在近曲肾小管内，sABC法,IgAN,TGFs2的表达，sABC法,IgAN，bFGF的表达，sABC法,IgAN,PDGF的表达，sABC法,骨骼肌营养不良，myosin蛋白表达，sABC法,第五节 免疫组织化学在病理诊断中的应用范围1.肿瘤诊断 未分化恶性肿瘤性质判定；

25、圆形、梭形、多形性肿瘤细胞鉴别；转移肿瘤的原发部位的确定。2.淋巴瘤的诊断 鉴定反应性增生疾病与淋巴瘤；各种淋巴瘤的分型。3.内分泌肿瘤的诊断（检测肿瘤分泌的激素)4.软组织肿瘤；神经系统肿瘤,5.小活检组织病理检查（能明确显示瘤细胞存在与否)6.微小癌、微小转移灶（淋巴结和骨髓)7.细针穿刺（细胞学诊断)8.部分肿瘤来源分类9.乳腺癌激素受体检测（ER，PR)10.肿瘤基因产物（p53,cerb-B2,ALK,CDs)11.增殖细胞核抗原（Ki-67，PCNA)判定肿瘤的预后12.病因诊断（HBV，HCV，EBV，CMV，HIV等),第六节 免疫组织化学在病理诊断中存在的不足1.与分子生物学

26、等技术相比，范围有限2.并非所有肿瘤均可以做免疫组化，因常无相应的抗体3.相当多的肿瘤缺乏特异性抗原的表达，同一种抗体，常 常可表达多种肿瘤4.免疫组织化学标准化问题,第四部分 免疫电子显微镜技术一、免疫电镜技术(immunoelection microscopy)是利用抗原和抗体特异性结合的原理，在超微结构水平定位、定性及半定量显示抗原的技术方法。从细胞超微结构水平研究和观察抗原抗体的免疫反应，必须使抗体带上具有高电子密度的标记物，这样才能在电镜下观察反应分结果。到目前为止，已有三种标记技术：(1)铁蛋白标记技术(2)酶标记技术(3)胶体金标记技术,二、免疫金标记技术（immunogold

27、staining technique)用胶体状态的金颗粒，作为抗体的标记物，制成免疫胶体金来研究抗原抗体的反应。在光镜下，胶体金呈鲜红色。电镜下，金颗粒电子密度大，有利于超微结构的观察。根据抗体特异性结合的原理，在亚细胞水平定性定位。对抗体加以标记，形成高电子密度区，在电镜下观察反应过程。在对细胞内抗原定性研究中，还可用不同的金颗粒标记同一细胞内不同的抗原。进行多重标记。,三、免疫电镜的基本技术方法1.标本的处理(1)取材:各种培养细胞和分离的血细胞应随用随取；游离的培 养细胞可先进行离心；贴壁细胞可在载玻片上固定，也可用胰蛋白酶将细胞消化下来；取组织块时应做到 越快越好，最好在没有停止血流前

28、取材。,（2）固定 固定液的选择：既要保存细胞的超微结构，又要尽可能的保存抗原的活性。A.多聚甲醛加低浓度的戊二醛固定液（PG固定液）B.过碘酸盐赖氨酸多聚甲醛混合固定液（PLP固定液）C.苦味酸多聚甲醛戊二醛固定液（PAPG固定液)固定方法与时间：A.血管灌注固定（最好方法）B.浸泡固定C.微波固定,2.基本技术方法（1）包埋前免疫电镜技术 是指先对标本进行免疫标记，然后进行包埋、切片、观察。（2）包埋后免疫电镜技术 是指组织标本经固定及树脂包埋，制作成超薄切片后再进行免疫化学染色方法。详见包埋前和包埋后电镜技术的比较,包埋前与包埋后的比较,肝细胞内的内质网和核膜，可见G-6-P酶阳性反应产

29、物。(32000),肝细胞。箭头指线粒体，线粒体嵴、内膜基质侧呈现琥珀酸脱氢酶阳性反应颗粒（36000）。,IgAN,TGFs2的表达，免疫金银法,IgAN,TGFs2的表达，免疫金银法,K4M低温包埋剂和紫外线低温包埋机联合的免疫电镜法（实验结果介绍）,免疫电镜技术是从超微结构水平能显示抗原和抗体结合后在细胞微细结构水平的定位，这一技术已成为目前生物医学领域的一项重要研究手段。但是，由于免疫电镜技术因多种原因造成的重复性差或技术的不稳定性，加之目前电镜包埋所采用的是环氧树脂618或812，都需高温聚合，这样可使多种抗原活性减低或丧失。本研究组选用了Lowicryls K4M低温包埋剂和紫外线

30、低温包埋机（SPI#17020），对免疫电镜观察的标本进行了处理，目的是更好的保存被检测组织中抗原的活性，提高检出率。现将一些不成熟的经验和存在的问题进行一下总结。,一、紫外线低温包埋机（SPI#17020）,SPI#17020是美国特殊研制的低温包埋机，它最主要的特点是采用数字化温度控制，通常采用干冰制冷，也可以使用液氮制冷，温度可以控制在-10-37之间。通过温度控制风扇可以使机内的温度控制在某一恒定温度，持续长达36小时，完全可以满足低温脱水、浸透和包埋所需的时间。它占地面范围小，但机内空间较大，可以同时放入72个包埋胶囊。而且机箱上方有两个封闭起来的波长为360nm的紫外灯，低温和室温

31、下的紫外线聚合都可以在包埋机中进行。总之，紫外线低温包埋机是很理想的低温脱水、浸透、聚合的机器。,二、Lowicryls K4M 低温包埋剂 Lowicryls K4M是丙烯酸盐和甲基丙烯酸盐化学物质，其特点是能在低温下保持低粘度，能很快渗入组织以及具有在波长360nm的紫外光照射下聚合的能力，它的光聚合作用与温度无关，而且Lowicryls K4M具有亲水性，因此它能较好地保持组织结构和抗原性，减少背景染色。,三、方法1.包埋剂的配制 商品提供的Lowicrys K4M包埋剂由三个部分组成：单体，交联剂和引发剂。调整单体和交联剂的比例，增加交联剂的量，组织块的硬度增加。中等硬度的组织块，其配

32、制比例如下：（1）Lowicryls K4M：单体 17.30g；交联剂2.70g；引发剂0.10g。可量取后，注入棕色的玻璃容器避光，用玻璃棒轻搅35分钟。勿过分搅拌，以防空气的气泡进入包埋剂中。（2）Lowicryls K4M的贮存：应保存在暗处室温下，该物质有刺激性，在配制时应戴手套，以免触及皮肤。在通风橱内操作，以免蒸气刺激眼睛。如触及皮肤和眼睛，应立即以水冲洗局部。,2.组织和细胞的取材、固定、处理（1）组织的取材与固定：用锐刀将新鲜组织切成13mm3的小块,迅速置于3%多聚甲醛-1%戊二醛固定液中,23h。（2）细胞的取材与固定：将含有细胞的培养液转移到离心管中，离心15min，使

33、细胞聚成团块，弃去上清夜，换上3%多聚甲醛1%戊二醛固定液固定23h。,（3）组织或细胞处理过程 将固定好的标本用0.01mol/L 磷酸缓冲液冲洗,10min3次；用0.5mmol/L NH4CL-0.1mmol/L PB（pH7.4）封闭游离的醛基30min；0.01mol/L 磷酸缓冲液1h；4 30%,50%乙醇脱水30min；-20乙醇系列逐级脱水至100%，各1h（乙醇溶液应先在冰箱中预冷）。-20低温包埋剂逐级渗透,纯包埋剂浸透过夜。标本放入含包埋剂的胶囊加盖后放入紫外线低温包埋机中，-20下用紫外线灯照射24h；室温紫外线灯继续照射34天，使样品完全聚合固化。超薄切片厚度507

34、0nm，展片后捞在覆有福尔马膜的镊网上。,3.免疫染色 免疫标记的切片用3%的H2O2 室温下处理610min后，用0.01mmol/L PBS缓冲液冲洗10min3次。然后在1%BSA-PBS封闭也上封闭30min，甩去不洗，滴加稀释好的一抗（如果用来自植物或微生物的蛋白做探针，标记温度最好在25左右2060min；用来自动物的蛋白做探针时，标记温度最好在30左右下2060min）。再次用0.01mmol/L PBS缓冲液漂洗和1%BSA-PBS封闭后用5nm胶体金IgG探针标记60min，最后经缓冲液冲洗，每次10min。阴性对照样品在标记前省却一抗孵育步骤。标记后的切片经醋酸铀和柠檬酸铅

35、各染色10min,用JEM-122O透射电镜下观察。,利用羊抗兔IgG胶体金探针对大鼠肺组织进行免疫金标记，结果显示在大鼠的肺泡壁内毛细血管内皮细胞胞浆中可见散在分布的金颗粒。对细胞进行免疫标记，待检测的物质位于细胞内时，最好采用10nm胶体金进行精细定位。如果待检测物质位于细胞壁，则采用1520nm胶体金。,四、结果,五、讨论 免疫电镜技术面临微细结构的保存和组织中抗原活性的保存这一对矛盾，本研究采用低温包埋剂和紫外线低温包埋机的方法缓解了这一对矛盾的发生。3%戊二醛和1%锇酸等固定液虽然有利于微细结构的保存，但对抗原活性有影响。采用的低浓度的戊二醛和多聚甲醛固定液既保存了抗原活性又有利于微

36、细结构的观察。电镜常温包埋所采用的环氧树脂618或812，在聚合过程中可能与组织成份发生反应而改变抗原性质，且二者都需高温聚合，可使多种抗原活性减低或丧失，包埋在环氧树脂中的组织不易进行免疫反应。,Lowicryls K4M低温包埋剂具有亲水性，可以在紫外线低温包埋机中进行低温聚合，它能较好地保持组织结构和抗原性，并可减少非特异的抗体吸附。紫外线低温包埋机内承载胶囊的承载架与紫外灯源的距离适中，其下面的反射体可以将紫外光均匀的反射到胶囊的底端，从而使包埋块硬度均匀，因此二者的结合使用能较好地应用在免疫电镜技术中。,总之，免疫电镜技术在科学研究和对疾病组织内特殊物质表达位置的鉴定以及量的多少具有

37、着广阔的发展前景。特别是在判定和评价光镜免疫细胞化学假阴性及假阳性结果时起着关键作用，其固定方法及包埋剂是免疫电镜标本制作过程中对抗原活性及超微结构保存最为关键的影响因素。使用低温包埋剂是免疫细胞化学方法成功的关键之一，紫外线低温包埋机可以自动控制温度，机箱内可容纳大量的包埋块，并且紫外线能充分均匀的照射组织块，使包埋块硬度均匀，利于切片。二者的结合使用为免疫电镜技术的普及创造了广阔的空间。,附：免疫金标记技术的应用范围（1）免疫金标记技术是金探针作为抗体与组织和细胞内抗原发生抗原抗体特异性反应，使金颗粒附着在反应部位，定位准确，金颗粒电子密度很高，EM下清晰可辨。（2）商品化的金探针购买方便

38、，价格低廉。根据实验要求可选择大小直径不同的胶体金颗粒（如3nm，5nm，10nm）（3）在超微结构水平上观察研究细胞表面和细胞器中的特异抗原和抗体等物质。也可对突触小泡内神经递质进行标记。,（4）金标探针可以加入到培养液中，对培养细胞抗原进行标记定位。（5）用于细胞骨架的研究。（6）可用于SEM和X线衍射分析。（7）分别使用不同直径的金探针，可以在同一切片上显示两种或两种以上的抗原即所谓双标记或多标记。（8）可用于标记石腊切片和半薄切片。（9）金探针无毒性，对人体无损伤，使用安全。,本部分内容的问答题1.什么是单克隆？什么是多克隆？说明两者特性的比较。2.免疫组化结果的评定标准。3.用于标记抗体的荧光素必须具备哪些条件？4.免疫组化非特异性染色的控制。5.免疫电镜技术的包埋前和包埋后的比较。,