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1、衣藻叶绿体中表达豆血红蛋白lba基因对其产氢影响的初步研究,成珍,豆血红蛋白,存在于大豆根瘤中的根瘤菌(以类菌体的形式存在)的固氮酶对氧十分敏感，必须在兼氧的条件下才有固氮的活性，在高氧或者无氧的环境中是没有活性的.但是存在于根瘤菌周围的豆血红蛋白可与氧进行可逆性结合，在类菌体的周围起氧缓冲的作用，成为阻止过多的游离氧接触固氮酶的屏障，豆血红蛋白还作为氧的载体，负担着在低氧环境中为类菌体呼吸提供氧的任务，使固氮酶免受氧的损害，保持高效的固氮活性。因此本研究将豆血红蛋白转入衣藻叶绿体中表达，利用豆血红蛋白与氧气可逆结合的性质，尝试在衣藻叶绿体中模拟大豆根瘤细胞的环境，创造一个低氧气环境的同时，结
2、合部分抑制PSII活性的措施；提高光合电子传递效率，提高衣藻产氢效率。,衣藻叶绿体外源基因的转化原理,外源基因转化入衣藻叶绿体时是通过同源重组方式即靠基因的同源片段的双交换方式定点将外源基因置换到衣藻叶绿体上。在构建叶绿体表达载体时，外源基因表达盒的前后分别连接有衣藻叶绿体基因组的同源片断，当载体进入叶绿体后，同源片断与受体基因组相应的片断发生同源重组，外源基因被整合到叶绿体的特定位点，随叶绿体基因复制和遗传，可以消除核转化的“位置效应”造成对基因表达的不利影响，实现高效表达,衣藻叶绿体外源基因转化的方法,莱茵衣藻叶绿体转化的方法主要有基因枪法和电击法。基因枪法又称高速微粒轰击法，是在真空室中
3、利用基因枪传递的高压氦气加速包被着DNA片断的金属微粒(金粉或钨粉)轰击受体细胞，这种方法转化效率高、重复性好、操作简便、适用于各种细胞类型，因而可用于衣藻的核转化、叶绿体转化和线粒体转化。电击法又称电脉冲法，是利用脉冲电场瞬间作用改变细胞膜的状态和通透性，形成可逆的瞬间通道，外源DNA通过通道进入细胞。该法操作简单快速、转化效率高、无菌操作容易控制，也常常用于细菌和高等植物的转化，转化效率同玻璃珠法相似。,实验方法,豆血红蛋白基因的克隆大豆总RNA的提取称取大豆成熟的根瘤o1g，液氮研磨，抽提大豆的总RNARNA浓度和纯度的检测将总RNA稀释50倍左右，用紫外分光光度计(EppendorfB
4、ioPhotometer)读取)OD260和OD280值，计算RNA浓度和纯度。,豆血红蛋白基因lba-cDNA、Ibc1-cDNA、Ibc2-cDNA、Flbr-cDNA的克隆(1)根据NCBI发表的lba基因序列(V00453J01299)、lbc1-cDNA基因序列(V00452J01300)、lbc2-cDNA基因序列(V00452J01301)、1)、Flbr-cDNA基因序列($70187)的序列分别设计相应的特异性引物,(2)PCR反应体系：根据以上lba、lbc1，lbc2、Flbr的cDNA序列所设计的特异 性引物(合成引物加适量的ddH20溶解，使其终浓度为10umolL)
5、以Soybean 总eDNA为模板，利用常规PCR技术分 别扩增出Iba-cDNA、Ibc1-cDNA、Ibc2-cDNA、Flbr-cDNA的基因片段。,(3)PCR反应条件：94预变性5min，一个 循环；94变性1min，62(1ba,lbc1,lbc2)、退火3.0s，72延伸lmin；30 个 循环；72延伸10min，PCR产物4保 存 备用。(4)PCR产物的鉴定：用1的琼脂糖凝胶 电泳 鉴定DNA的大小。如果大小正确,则将PCR产物纯化后连接到通用载体 pEGMEasyTVector(Promega)(以下简称Tvector)上，再送测序公司检 测PCR产物碱基序列的正确性。,
6、(5)PCR产物的纯化：DNA胶回收(TakaraAgaroseGelDNAPurificationkit)：电泳结束后，切下含目的片段的琼脂糖凝胶块，放入15ml离心管中，加入3倍体积BindingBuffer，5水浴10min直至彻底 融化；将融化的胶溶液转移到柱中，室温放置2min，8000 rmin离心l min，弃收集管中的废液；取下UNIQ-10柱子，倒掉收集管中的废液，将柱子放入同一个收集管中，加入500ulWashSolution，8000rmin离心1min；重复清洗二次(重复步骤5)后将UNIQ-10柱子放入一新的15ml的离心管中，在柱子膜中央加30uLElutionBu
7、ffer(PH7)，室温放置2 min 12000rmin离心1 min，离心管中液体即为回收的DNA片段，可立即使用或20冷藏备用。,载体的构建,质粒DNA的制备(碱裂解法小量制备质粒DNA)收集培养过夜至对数生长后期的菌液，用STE缓冲液洗去培养基；菌体悬浮于预冷的溶液I，激烈振荡，使细胞完全分散：冰浴，加入新鲜配制的溶液lI，快速颠倒离心管几次，使内容物充分混匀；冰浴，加入预冷的溶液III颠倒离心管温和振荡，使内容物混匀，冰浴；离心，吸取上清移至另一离心管中，加入Tris饱和酚j振荡混匀；离心吸取上层水相转移至另一离心管中，、用氯仿异戊醇处理12次；向最后吸取的上层水相中加入2倍体积的无
8、水乙醇，轻轻振荡混合，于室温中放置沉淀DNA。离心弃上清，加入70乙醇洗涤沉淀；离心去净上清液；把沉淀干燥后的沉淀溶于TERNA酶缓冲液中，55水浴，冷却到室温后20保存备用。,以T-lba的DNA为模板扩增lba基因,构建质粒载体的连接反应体系 在20ul反应体系中，加入经过BamHl和SacI双酶切载体DNA(pET-32a)，和经过BamHI和SacI双酶切得目的片段(1ba的酶切产物)用双蒸水补足体积，14-16保温1216小时，即可转化大肠杆菌感受态细胞。用双蒸水补足体积，14-16保温1216小时，即可转化大肠杆菌感受态细胞.,25大肠杆菌感受态细胞的制备,从37倒置培养过夜的平板
9、上挑取单菌落，接种到5mlLB液体培养基中，37过夜培养；再将细菌以1的比例接种到100mlLB液体培养基中，继续培养35小时二次活化至OD600为10左右；将培养物转入一次性使用的冰预冷的50ml的doff管中，在冰上放置10min，使培养物迅速冷却到0，4 下4100rpm离心10min，弃上清；用2ml冰预冷的CaCl2(0.1 M)悬浮细胞，于4 下4100rpm离心10min重复两次；用2ml冰预冷的CaCl2(0.1M)重悬沉淀，每管取200ul分装于预冷的15ml离心管中，4保存，可用一周,大肠杆菌的转化,取制备好的感受态细胞，放置于冰上；在感受态细胞中加入5ul连接产物或1ul
10、质粒，轻弹混匀，冰浴30min；42(热激温度很重要)水浴90s，不要摇动管；快速冰浴1-2min；每管加800ulLB培养基(37预热)，37摇床摇动温浴45min。将100ul已转化的感受态细胞涂至37预热的含相应抗生素的LB平板上。将平板放置于超净台中吹至液体被吸收；倒置平板，37下培养12-16h可出现菌落，4保存,克隆载体的鉴定,取适量克隆载体(或连接产物)转化的大肠杆菌分别过夜培养，提取质粒，在适当浓度的含有EB的琼脂糖凝胶中电泳，参考对照质粒载体或DNAMarker的分子量作初步的判断，选择大小正确的克隆进一步用限制性内切酶分析和PCR及测序分析,目的基因在大肠杆菌中的表达及蛋白
11、抗体的制备,IPTG诱导目的基因的表达将构建好的质粒pET-32a-Iba转入宿主BL21中，挑取单个阳性克隆进行划平板保存并液氮冻存备用。挑取转化了正确表达的pET-32a-lba的BL21菌单克隆，在含有Ampr抗生素的LB液体培养基中培养过夜。当OD600达到0.6左右时即可以1的接种量接入新鲜的含有Ampr抗生素的LB培养基中进行二活。当OD600达到0.4时，即可加入终浓度为1mmolL的IPTG进行诱导，30下225rpm振荡培养，分别在0h、05h、1 h、2h、4h和6h取出诱导的菌液在4下保存，待下一步处理。将上述收集的菌液在4下8000rpm离心5min，收集菌体。用tri
12、s-Cl(50mM，pH=7.4)清洗细胞两次，每次在4下12000rpm离心10min，弃上清；最后用1xBindingbuffer重悬菌体，以10s超声、20S间隔的频率冰浴超声30次，等菌液变得澄清之后，在4下12000rpm离心10min，上清液为可溶性的蛋白，沉淀为不可溶性的蛋白，分别准备进行SDS-PAGE检测。,目的蛋白的SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)检测,首先根据BIO-RAD的说明书安装玻璃板和电泳仪。配制SDS-PAGE胶，配方见表2-6。进行SDS-PAGE电泳：每孔加入约1肛l蛋白样品，再最后的孔中加入10ul小蛋白maker。刚开始电泳时在浓缩胶中的电压为60
13、v，溴酚蓝进入分离胶中时电压调到80v，溴酚蓝电泳到离胶底处即停止电泳。取出蛋白胶，并用考马斯亮蓝染色，脱色液脱色后鉴定lba蛋白的大小。,衣藻叶绿体表达载体的构建,通过对cg40质粒的rbcL基因和aadA基因做诱变PCR(图21)(引物为lba-5-leftprimer和lba-3一rightprimer)，将存在于3psbD和rbcL3UTR之间的单一多克隆酶切位点(multiplecloningsites简称为：MCS)转移到aadA和rbcL3UTR之间，即获aadA+MCS+rbcL3UTR 串联基因，改造后的质粒命名为cg40i一i,251衣藻的纯化及培养(1)藻种纯化培养培养基
14、为Tris-Acetate-Phosphate(TAP)，初始pH=7.2。在TAP培养基中加入质量1.5的琼脂粉，制成固体培养基平板，再将待分离纯化的藻液通过划线方法接种在平板上，置于培养箱中，25培养，每3-4周继代一次。从平板上挑取单藻落，接入100ml液体培养基中，在培养箱中以(光照强度100uE(m2 s)PAR，温度25士1)。的光强光照静置或水平转速为120rpm培养每5天继代一1次。(2)莱茵衣藻的扩大培养：在1000ml的三角瓶内加入400mlTAP培养基接种莱茵衣藻(接种量为l)，摇床培养5-7天左右，转速120rpm，光照强度100umolm-2.s-1，温度25士1。,
15、用分光光度计测定转基因衣藻849-1ba,cg40、cg40i-i和转基因之前的藻种849的OD750及叶绿素在培养7天内的变化情况，制作生长状态及叶绿素含量变化曲线图,莱茵衣藻849及849-1ba的生长状态比较,图为莱茵衣藻849，cg40,cg40i-i，及849-1ba的生长状态(A)及叶绿素舍量(B),对照组(莱菌衣藻849、cg40，cg40i一I,及转基衣藻849lba的生长和叶绿素含量变化趋势基本一致，藻细胞均在第3天进入对数生长期，第4、5天达到饱和期，之后就趋于平稳；对照组(转基因藻cg40 cg401一I,与衣藻849)的生长速度基本一致，OD750都在第四天达到3.5左
16、右，约等于细胞数为7080 x106个，叶绿素含量达到33mg/L左右，但转基因藻lba的OD750在第四天才达到2.7左右，约等于细胞数为6.07.0 x106个，低于对照组20左右；叶绿素含量约为27mgL左右低于对照组18左右。该实验结果说明，Iba基因的转入在一定程度上会影响衣藻的生长。,转基因衣藻849-lba与莱茵衣藻849的耗氧及产氢量比较,本实验检测了转lba基因藻849-lba与未转lba基因的衣藻849在密闭培养瓶内产氢和耗氧量情况，每天定时监测，一共检测了8天。从图3-19中看出，在正常TAP中培养中，衣藻849-lba和849的产氢量在培养的前4天基本一样，而且是随时间
17、逐渐增加到50-60ul左右；衣藻849在第5天到第8天的产氢量仍然维持在60ul左右，而衣藻849-lba的产氢量在第5天迅速升高到90ul，其最高产氢量比衣藻849高约50(图319，A)。比较二者的氧气含量可见培养的前3天，转lba基因比未转基因的衣藻849的氧气消耗量低了l倍，从第4天开始，转lba基因衣藻含氧量仍然一直维持在5左右，比衣藻849的低了4倍(图319，A)。衣藻849的产氢速率最高只有每小时0.68ulmgChl，而转lba基因衣藻的产氢速率最高达到每小时0.75ulmgChl，明显比849的产氢速率要高出11.6(图319，a)。,因为培养基中缺硫能提高衣藻的产氢效率
18、，在TAPS培养基下，衣藻849和849-lba的产氢量都是在接种后迅速提高，但转lba基因衣藻的产氢量升高得明显比衣藻849快，到第6天约为178ul，比衣藻849高29(图319，B)；此时转lba基因衣藻的产氢速率为2.25ulmgChlh-1，也比衣藻849的高82(图3-19，B)。比较二者培养系统内的氧气含量发现：从接种开始到第3天，转lba基因的衣藻培养系统内的氧气含量下降速度就比849快，从第1天到第3天衣藻849-lba体系的氧气含量从22降到3，比衣藻849的大约低约82(图319，b)。,lba基因的转入对衣藻耗氧和产氢量的影响,衣藻产氢的最大障碍是氢化酶对氧气及其敏感，
19、为了提高衣藻的产氢效率，改造氢化酶和降低细胞内氧气含量是主要的途径。目前降低衣藻细胞内氧浓度的主要方法是使用缺硫培养基，但是缺硫培养抑制UPSII光解水所释放的电子，所以抑制UPSII活性最终也导致产氢率下降。,本实验将能与氧气可逆结合的豆血红蛋白基因lba转入到衣藻的叶绿体中表达，希望通过豆血红蛋白的作用，达到降低细胞内氧气含量的同时又能增加光合电子产量，最终提高衣藻的产氢量。实验通过高效气相色谱对转基因藻849-1ba及衣藻849进行产氢检测，结果表明：在TAP正常培养基中，转基因藻849-1ba的产氢量比849提高了50；产氢速率比849提高了82，转基因藻849-1ba的氧气消耗量开始
20、比衣藻849快，氧气含量比衣藻849少1-4倍。在TAP-S的培养基中，转基因藻849-1ba的产氢量比849提高了29；氧气含量比衣藻849降低33-56。说明转Iba基因的衣藻能在一定程度上降低了氧气含量、提高了产氢量。有研究指出，当氧分压达到2时，氢酶就会迅速失活。因此整个光照产氢过程必须持厌氧状态才能产氢，本研究的多次实验中发现，密封培养瓶上方封存的气体中氧气含量都大于2，但仍能检测到有氢气产生，这可能由于氧气是难溶气体，气液间的传输属于液膜控制，因此如果呼吸耗氧速率大于光合速率，使藻细胞内较藻液体系先转变为厌氧状态，使位于叶绿体内的氢酶能够充分表达产生氢气。,The end thank you,
