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1、逆流色谱技术,蒋志国海南大学食品学院,掌握逆流色谱技术原理、仪器类型、系统构成、应用领域；逆流色谱技术与其它色谱技术比较的优缺点；如何将逆流色谱技术应用于食品科技领域。重点内容：逆流色谱技术原理、逆流色谱技术与其它色谱技术比较的优缺点难点内容：如何将逆流色谱技术应用于食品科技领域,逆流色谱技术历史,Y.Ito et al,Nature,212,985,1966.(现象)Y.Ito and R.L.Bowman,Science,167,281,1970.(封闭型)Y.Ito and R.L.Bowman,Science,173,420,1971.(流通型)Y.Ito and R.L.Bowman
2、,Science,182,391,1973.(双水相)Y.Ito,J.Suaudeau and R.L.Bowman,Science,189,999,1975(非同步).,Dr.Yoichiro Ito discovery,运动螺旋管内两液相对流分配的现象，是逆流色谱的物理基础。这一现象是DrIto于1966年在日本大版大学医学院首先发现的，随后，DrIto赴美在美国国家健康研究院(NIH)工作，于1970、1971年两次在“Scince”杂志上发表了对该技术基本模型的研究结果。此后他针对抗生素、肽、氨基酸等特定样品的分离课题，在实验室不断完善相应的试验模型与实验样机，获得了一系列的发明专利，
3、发表了一系列的研究论著，为逆流色谱技术的发展打下了初期的基础。1980年，张天佑的小组研制出我国第一台逆流色谱仪器，并由检定所抗生素室用于抗生素成分的分离与分析检定。随后在蔡定国教授等植物药学专家的帮助与合作之下，完成了首批生物碱、黄酮等类中药成分的分离应用研究，其结果发表后引起了国内外的关注。这些工作使我国在逆流色谱技术及其应用研究方面处于国际的前列。2006年，杜琪珍创立了低速逆流色谱技术，并因此荣膺获得国际逆流色谱协会颁发的最高奖爱德华周（Edward Chou Award）奖。,两相在管路中的流动与分布,极低速(300rpm):行星式 保留好 混合 自转式 保留好 无混合,逆流色谱技术
4、原理,高速逆流色谱是建立在一种特殊的流体动力学平衡的基础上，利用螺旋管的高速行星式运动产生的不对称离心力，使互不相溶的两相不断混合，同时保留其中的一相(固定相)，利用恒流泵连续输入另一相(流动相)，此时在螺旋柱中任何一部分，两相溶剂反复进行着混合和静置的分配过程。流动相不断穿过固定相，随流动相进入螺旋柱的溶质在两相之间反复分配，按分配系数的大小次序被依次洗脱。,高速逆流色谱仪器的装置,它的公转轴水平设置，螺旋管柱距公转轴R处安装，两轴线平行。通过齿轮传动，使螺旋管柱实现在绕仪器中心轴线公转的同时，绕自转轴作相同方向相同角速度的自转。,高速逆流色谱分离过程,达到稳定的流体动力学平衡态后，在对管柱
5、里两相溶剂状态进行频闪观察时发现，管柱里会出现如下图所示的两个绝然不同的分布区带：在靠近离心轴心大约有四分之一的区域，呈现两相的激烈混合(混合区)；其余区域两溶剂相分成两层(静置区)，较重的溶剂相在外部，较轻的溶剂相在内部，两相形成一个线状分界面。,图(a)所示为螺旋管在连续转动的不同位置(I、)时，观察到的其中两相分布情况。图(b)则表示将对应于不同位置(I、1V)的螺旋管拉直，以更明显地表示混合区域在螺旋管内的移动，即每个混合区带都向螺旋管的首端进行，其行进速率和管柱的公转速率相同。表明，当流动相恒速通过固定相时，两相溶剂都在反复进行混合和静置的分配过程，这一过程频率极高，当柱以800 r
6、/min旋转时，频率超过13次/s，所以高速逆流色谱有相当高的分配效率。,高速逆流色谱优点,应用范围广，适应性好。由于溶剂系统的组成与配比可以是无限多的，因而从理论上讲HSCCC适用于任何极性范围的样品的分离，所以在分离天然化合物方面具有其独到之处。并因不需固体载体，而消除了气液色谱中由于使用载体而带来的吸附现象，特别适用于分离极性物质和其它具有生物活性的物质。操作简便，容易掌握。分离过程中对样品的前处理要求低，仅需一般的粗提物即可进行HSCCC的制备分离或分析。回收率高。由于没有固体载体，不存在吸附、降解和污染，理论上样品的回收率可达100。在实验中只要调整好分离条件，一般都有很高的回收率。
7、,高速逆流色谱优点,重现性好。如果样品不具有较强的表面活性作用，酸碱性也不强，那么多次进样，其分离过程稳定性都保持很好、峰的保留相对标准偏差也小于2%，重现性相当好。分离效率高，分离量较大。由于其与一般色谱的分离方式不同，能实现梯度操作和反相操作、亦能进行重复进样，使其特别适用于制备性分离，产品纯度高。研究结果表明:一台普通的高速逆流色谱仪一次进样可达几十毫升，一次可分离近10g的样品。因此，在80年代后期被广泛地应用于植物化学成分的分离制备研究。,高速逆流色谱溶剂系统的选择,高速逆流色谱是利用组分在逆向移动的互不相溶的两相中的分配行为的差异，即分配系数的差异，而实现不同组分的分离。首先，根据
8、相应化学成分的溶解特性和极性强弱，选择相应的两相溶剂体系；然后通过测定相应成分在不同比例溶剂体系中的分配系数确定溶剂体系中各种溶剂的具体比例，从而确定最佳高速逆流色谱分离的两相溶剂系统。,分配系数的测定,薄层色谱法:高效液相色谱法(HPLC)：取适量样品溶于一定体积的某一相中(上相U)，用HPLC测定U相，所得组分的峰面积记为Au1，；然后加入一定体积的另一相(下相L)，振荡分配平衡后用HPLC再测定U相，所得组分的峰面积记为AU2。根据下式计算各个组分的分配系数：,适宜的两相溶剂体系应是组分的分配系数K在0.52之间。如果分配系数太小，组分的保留时问太短，不利于分离；如果分配系数太大，则保留
9、时间太长，组分峰展宽严重，峰高降低，峰型变差，严重时无法进行峰的区分。对于要分离的两组分，两组分分配系数之比K2K11.2，即Rs=1，即可得到较好的分离效果，此时两组分峰重叠约为2；两组分分配系数之比K2K1 1.3，即Rs=1.5，可得到良好的分离效果，此时两组分峰重叠小于1。在进行高速逆流色谱分离条件优化时，可以以此为依据进行两相溶剂系统的选择。,分配系数的选择,分离机理,TR=V(1+(K-1)SFFcTR保留时间V柱体积K被分离组分的分配系数SF固定相保留率Fc流动相流速,逆流色谱的溶剂系统,卤代烷-水系列烷烃-水系列乙酸乙酯-水非水相系列双水相系列,1.1 1 卤代烷系列,卤代烷系
10、列,乙酸乙酯系列,丁醇系列,烷烃系列,非水相系列系列,双水相系列,16%(w/w)PEG 1000-12.5%(w/w)potassium phosphate at pH 8.0 and pH 9.216%(w/w)PEG 1000-8.3%(w/w)potassium phosphate at pH 7.0,逆流色谱的应用领域,小分子有机物（如黄酮、糖甙、单宁生物碱、维生素等）蛋白质、核酸等活性大分子（海产品中的活性蛋白，活性多肽）细胞（血球细胞，酵母细胞等）无机成分（稀土元素）既可作为实验室分离手段，又能用于制药行业的工业化分离纯化,High-speed countercurrent ch
11、romatograph(HSCCC)高速逆流色谱仪,Rotational speed:500rpm,The design principle of the planetary centrifuge system for HSCCC 行性式运转高速逆流色谱仪设计原理,A cross-sectional view of the original HSCCC 高速逆流色谱仪剖面图,立式柱高速逆流色谱仪,Brunel University,UK.Each column:45 m,3.6mm i.d.stainless steel Total capacity:930 ml.花青菜20 g glucor
12、aphanins from broccoli was separated to yield 1.8gglucoraphanin with high purity.4-甲基亚磺酰丁基芥子油苷Each column made of 29m of 10mm bore PFA tubingTotal capacity of 4.6 L,A 25 g mixture of benzyl alcohol and-cresol Solvent system composed of heptane-ethyl acetate-methanol-water(1.4:0.1:0.5:1.0)Flow rate o
13、f 600 ml/min Excellent resolution.,HSCCC Scale-up by two columns connected in series,HSCCC equipped with triple columns in series三柱串联高速逆流色谱仪,高速逆流色谱仪(总柱容积:2460 ml),可用于克量级制备,HSCCC separation of 3 g of crude isoflavones obtained from the 1200-ml capacity convoluted column.Experimental conditions:column
14、,1200-ml capacity;sample,3 g of crude isoflavones(异黄酮);solvent system,hexane ethyl acetate-butanol ethanol acetic acid water(1:2:1:1:5:1,v/v);mobile phase,lower aqueous phase:flow-rate,5 ml/min;revolution,700 rpm.,HSCCC separation chromatogram of tea extract(茶提取物)with the Pharma-Tech apparatus equip
15、ped three serially connected multilayer columns(850ml).Conditions:solvent system,n-hexane-ethyl acetate-water(1:7:10);stationary phase,upper organic phase;flow rate of 2.5 ml/min;retention:44%;rotational speed,650 rpm.EGC,epigallocatechin;D,L-C,catechin;EC,epicatechin;EGCG,epigallocatechin gallate.,
16、HSCCC chromatogram of 16 g of the dried leaves extract of Ampelopsis grossedentata(藤茶).Solvent system:n-hexaneethyl acetatemethanolwater(1:3:2:4,v/v);stationary phase:upper phase;flow-rate of the mobile phase:5.0 ml/min;revolution:650 rpm;retention of stationary phase:55%,2460ml column.,HSCCC separa
17、tion of 12 g of the crude extract of S.marianum(水飞蓟).1,unknown;2,silychristin;3,silytin;4,isosilytin.Hexanen-butanolmethanolwater(1:4:2:6,v/v),2460-ml capacity column,HSCCC separation of 8 g of the E.segittatum(淫洋藿)crude extract obtained from the triple-column CCC instrument(2460ml).Solvent system:n
18、-hexanen-butanolmethanolwater(1:4:2:6,v/v);stationary phase:upper phase;flow-rate:5.0 ml/min;revolution speed:650 rpm;retention of stationary phase:46%.,Slow rotary countercurrent chromatograph低速逆流色谱仪,rotating the coil slowly around its horizontal axis at a critical speed(临界转速)that yields high reten
19、tion of the stationary phase 20-150 rpm,杜琪珍,2006年，第四届国际逆流色谱学术会议上，杜琪珍在低速逆流色谱技术建立中作出的突出贡献受到逆流色谱创立者、美国著名科学家Yoichiro Ito博士及与会专家的高度评价，并因此荣膺获得国际逆流色谱协会（International Society for Countercurrent Chromatography）首次设立并颁发的最高奖爱德华周（Edward Chou Award）奖。爱德华周奖，是为纪念为逆流色谱技术在全世界范围内的推广作出杰出贡献的爱德华周博士而设立的。该奖今年首次设立今后将每两年颁发一次
20、，每次只有一名科学家获此殊荣,Cutaway view of slow rotary countercurrent chromatograph with a 10liter capacity column 低速逆流色谱仪剖面图,低速逆流色谱仪(柱容积:10400 ml),可用于10-100克级制备,8.5 mm I.D convoluted tubing,Preparative chromatogram of pueraria root extract(葛根提取物).Experimental conditions:sample,30 g of peeraria root extract in
21、300 ml of solvent consisting of equal volume of each phase;solvent system,n-hexane-ethyl acetate-n-butanol-water-acetic acid(1:1:2:6:0.2);mobile phase,lower phase;elution mode,head to tail;flow rate,5 ml/min;column rotation,21 rpm.,Preparative chromatogram of crude extract of tea leaves obtained by
22、the present method.Experimental conditions:sample,150 g of tea leaves extract(茶提取物)dissolved in 1.2 L of solvent consisting of equal volumes of each phase;solvent system,n-hexane-ethyl acetate-I-butanol-water-acetic acid(0.5:1:2:6:0.2);mobile phase,lower phase;elution mode,head to tail;flow rate,5 m
23、L/min;column rotation,21 rpm,Sketch of slow rotary CCC with rotary seals,Scale up with 17 mm I.D convoluted tubing用17 mm I.D 螺纹管放大,40升低速逆流色谱仪,Solvent system:Secret;Stationary phase:Upper organic phase;Rotary speed:70 rpm;Sample amount:500 g of pueraria root extract in 3000 ml lower phase;Mobile flow
24、 rate:50 ml/min.,pH区带逆流色谱技术,pH区带逆流色谱(pH-zone-refining CCC)是分离制备离子型化合物的一种有效方法。它利用溶质具有酸、碱特性来进行聚焦和分离，它具有高分辨率，能分离和纯化许多具备酸碱特征的有机化合物。溶质的分配系数与标度值的差异决定了出峰时间，从而实现分离。目前，pH区带逆流色谱技术已成功地应用于下列物质的酸性或碱性衍生物：生物碱、多肽、氨基酸、染料、吲哚类植物激素、结构异构体、光学异构体等。,DNP氨基酸的pH区带逆流色谱分离.在流动相中分配添加乙酸、丙酸、丁酸,离子对逆流色谱技术,离子对逆流色谱(ion-pairing CCC)是制在固
25、定相中加入离子对配位体，以改变被分离组分分配系数的逆流色谱方法。实验中使用较多的离子对是DEHPA，它已广泛应用于分离稀土元素、儿茶酚胺和多肽。它为分离同系物，结构相似的化合物提供了有效的途径。,手性逆流色谱技术,用逆流色谱分离外消旋对语映体手性化合物。采用溶剂系统正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水，在固定相加入手性选择体N-十二烷酰-L-脯氨酸-3，5-二甲基苯胺可分离系列N-（3，5-dintrobenzoyl）-D，L-氨基酸。,逆流色谱系统构成,储液瓶 输液泵 进样装置 逆色谱仪 检测器 部分收集器,逆流色谱仪系统,Pharma-Tech逆流色谱分离系统,PC-Inc.逆流色谱分离系统,Pha
26、rma-Tech高速逆流色谱仪,SLCCC System,低速逆流色谱仪(柱容积:升),可用于100-1000克级制备,与其它色谱比较的优点,逆流色谱技术是近三十年来发展起来的一种液液色谱技术。该技术有以下几方面的优点：能构成连续、自动、高效和非高压的色谱系统，其分离的效率可与高效液相色谱相比。既能用于未经严格预处理的大量粗制样品的分离，又能用于高纯度单体的分离。能在一个流程中分离复杂样品中极性差异极大的各个组分，特别是能有效地分离强极性的组分。仪器设备简单、价廉、操作方便、样品无损耗或沾染、溶剂用量少、处理样品大等优点。从根本上消除传统柱色谱分离（硅胶、聚酰胺、凝胶、合成键合相材料等）的不可逆吸附现象，样品在分离后可以100%回收。,逆流色谱在食品科学领域的应用,Thank you for your attention.,
