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1、实验八 酮体的生成和利用,一、实验要求：1、加深理解何谓酮体，是怎样生成和利用的。2、掌握酮体定量测定的方法。3、了解活组织培养是研究中间代谢的基本方法。4、掌握分光光度计的正确使用。,二、原理：酮体是脂肪酸氧化的正常中间产物，包括乙酰乙酸，羟丁酸和丙酮三种物质。主要在肝脏中生成，而在肝外组织氧化。,本实验以丁酸钠为底物，与肝组织或肌肉组织糜一起或分别保温培育，测定培育液中酮体的含量。两种情况下的酮体含量的差别，可帮助我们理解上述理论。,酮体定量:(丙酮)1、丙酮+2,4二硝基苯肼 丙酮 2,4二硝基苯腙2、在酸性条件下用CCl4将丙酮 2,4二硝基苯腙分离 提取而与其它苯腙衍生物分开。,3、
2、苯腙在碱性条件下，呈现红棕色，颜色的深浅与丙酮的含量在一定范围内呈直线关系，故可用比色分析法测定丙酮的含量。该法也可用于临床血和尿中酮体的定量测定。,三、试剂：1、15 三氯乙酸（酶蛋白变性，终止反应）2、丙酮标准液：0.079 mg/ml,四、主要器材：1、剪刀、镊子一套，50 mL 锥形瓶4个，10 mL 具塞试管6支，离心管4 支2、恒温振荡器、离心机、分光光度计3、兔子(室温1020饥饿 48 小时）,恒温振荡器,五、操作步骤（6人一组）1、肝组织糜与肌组织糜的制备（糜倒入塑料筐）取肝脏5g，置于表面皿上，用剪刀剪细剪匀，为肝组织糜，平均分成4份（每份约1g）。不要捻碎！取肌肉约5g，
3、按上述方法制成肌肉组织糜，平均分 成2份（每份约2g）。,2、取50mL锥形瓶4只，编号，按下表添加剂：混匀，置于37恒温振荡器中振荡2小时。,摇匀后在测定瓶2和4中加入15三氯乙酸2.5mL,3、振荡后，取出锥形瓶，摇匀后在测定瓶1和3中分别加入15三氯乙酸2.5mL，混匀，静置10分钟，然后各瓶分别倒入4支离心管中，2000rpm 离心10分钟（弃去残渣，注意离心管平衡）。,4、取10mL具塞试管6支，其中4只分别加入上述滤液 3.0mL，1支作为标准管，内加丙酮标准液3.0mL，1支作为空白管，内加试剂混合液3.0mL。然后各管分别加入酸性2,4二硝基苯肼2.0mL，CCl4 3.0mL
4、，塞紧。,1、剧烈振荡7分钟（注意放气体），静置，用滴管吸去上层酸液（先吸除泡沫）。2、用5mL蒸馏水洗1次，振荡3分钟，除去上层水液（除去苯肼）。3、各管中再分别加入0.5mol/LNaOH溶液4.0mL，将塞塞紧剧烈振荡3分钟。,5、取上层碱液，波长520nm，进行比色测定。（若混浊，3000rpm 离心5分钟）6、结果（A1A2，A2 A4）,6、计算1g肝组织2小时生成酮体的 mg 数(以丙酮计)=(A1-A2)/A标 0.079 3 12/3=(A1-A2)/A标 0.948,2g肌肉2小时利用酮体的 mg 数(以丙酮计),六、注意事项：1、在分离提取过程中，若泡沫过多可用离心法除去。2、比色液若有混浊，在比色前，可进行离心。3、组织糜要均匀，称量分份尽可能要准确。,思考,影响组织培养的因素有哪些？其中本实验需注意的有几点？,
