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1、实时荧光定量PCRReal-time quantitative PCR,北京康为世纪生物科技有限公司Beijing CoWin Biotech Co.,Ltd.,王春香 博士 执行董事兼总经理北京大学生物系学士和硕士学位美国加州大学洛杉矶分校（UCLA）病理系博士学位1999年回国 2002年创办北京天为时代科技有限公司 2005年被QIAGEN收购-天根2007年底创建北京康为世纪目标：成为中国的Invitrogen,北京康为世纪生物科技有限公司,康为世纪生物科技有限公司,分子生物学 全系列产品蛋白生物学产品免疫学相关产品,北京康为世纪生物科技有限公司,我们的客户,我们的合作伙伴,北京大学、
2、清华大学、复旦大学中国科学院、军事医学 科学院301医院、协和医院、上海瑞金医院华大基因、诺华制药,江苏泰州中国医药城临床诊断试剂研发及中试平台3000平米实验室及GMP厂房,主要内容,荧光定量PCR原理荧光定量PCR具体案例荧光定量PCR技术服务,荧光定量PCR基本概念,实时荧光定量PCR：（Real-time qPCR）利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线实现对起始模板的定量分析。,非特异性荧光标记：SYBR Green I 特异性荧光标记：水解探针：TaqMan非水解探针：Molecular beacon,荧光定量PCR检测原理,SY
3、BR Green I 是一种与双链DNA小沟结合的荧光染料。SYBR Green I只与双链DNA结合才能发出荧光。荧光信号的强度与反应体系中所有双链DNA分子成正比。,SYBR Green I 工作原理,在退火过程中，探针与靶序列结合,探针被Taq酶的5-3 外切酶活性剪切成片断,游离报告基团发出荧光,在延伸过程中，探针部分与靶序列分离,荧光信号强度与结合探针的DNA分子成正比。,TaqMan工作原理,探针法（TaqMan）特异性高-与探针与特异靶序列结合对模板有选择性-可进行多重PCR反应成本高-不同靶基因需要合成不同探针,染料法（SYBR Green I）通用性好-对DNA模板没有选择性
4、使用方便，成本低-仅需设计两个引物有假阳性现象-通过融解曲线判断,荧光定量PCR检测方法对比,基因表达分析相对定量：基因表达量的差异绝对定量：样本中核酸的量（拷贝数、微克）基因型分析SNP检测等位基因检测甲基化检测,荧光定量PCR应用,荧光定量PCR流程,12,荧光定量PCR,RNA提取,逆转录,基因组DNA提取,主要内容,荧光定量PCR原理荧光定量PCR具体案例荧光定量PCR技术服务,荧光定量PCR 相对定量分析,实验目的：检测OCT基因在普通小鼠和转基因小鼠中的相对表达差异。材料与方法：材料：普通小鼠肝脏和转基因小鼠肝脏 检测指标：目的基因：OCT；内参基因：actin 方法：相对定量，S
5、YBR Green 法 试剂：#CW0581 超纯RNA提取试剂盒#CW0744 HiFi-MMLV第一链合成试剂盒#CW0956 UltraSYBR Mixture,target gene目的基因,reference gene内参基因,total RNA,cDNA,total RNA,cDNA,target gene目的基因,reference gene内参基因,qPCR,qPCR,数据分析,荧光定量PCR实验流程,普通小鼠,转基因小鼠,样本处理与保存RNA样本保存液 RNA的提取与纯化裂解细胞：异硫氰酸胍/酚 VS 胍盐/巯基乙醇纯化方法：沉淀法 VS 柱式分离法 举例：#CW0580 T
6、rizon#CW0581 超纯RNA提取试剂盒,样本处理与RNA提取,RNA的评价与鉴定,RNA评价与鉴定 完整性 纯度注意：小心DNA污染！DNase处理 引物设计 以RNA作PCR阴性对照,RNA电泳图,target gene目的基因,reference gene内参基因,total RNA,cDNA,total RNA,cDNA,target gene目的基因,reference gene内参基因,qPCR,qPCR,数据分析,荧光定量PCR实验流程,普通小鼠,转基因小鼠,逆转录,逆转录引物下游应用：是否检测其它基因？Abundant RNA的干扰：mRNA or total RNA？检
7、测灵敏度是否足够？逆转录酶RNase H活性热稳定性,逆转录,逆转录：#CW0741 Super RT逆转录酶#CW0743 HiFi-MMLV逆转录酶举例：#CW0744 HiFi-MMLV cDNA第一链合成试剂盒RNA：提取的普通小鼠肝脏RNA和转基因小鼠肝脏RNA引物：包含两种逆转录引物，oligo（dT）和Random hexmer。反应条件：42孵育50分钟，70孵育15分钟。,target gene目的基因,reference gene内参基因,total RNA,cDNA,total RNA,cDNA,target gene目的基因,reference gene内参基因,qPC
8、R,qPCR,数据分析,荧光定量PCR实验流程,普通小鼠,转基因小鼠,内参基因的选择,特点,选择内参基因,内参基因,beta-actin、GAPDH、18S rRNA、28S rRNA等,-文献检索-实验筛选选择多个备选内参基因，以备选内参基因的几何平均数作为均一化标准,-RNA抽提、反转录为cDNA的效率不同，用于定量分析的样本初始浓度不同。,对样本初始浓度差异进行均一化校正。,不同环境，不同器官、组织、细胞类型之间，表达量相对恒定。,内参基因Housekeeping Gene,引物设计原则,总原则与普通PCR相同：避免引物二聚体，避免二级结构扩增片段长度（80 300 bp)推荐做跨int
9、ron设计,反应条件优化,内参基因 目的基因 扩增曲线融解曲线标准曲线,扩增曲线分析Ct值,反应条件优化,融解曲线分析单一特异性产物,将温度对荧光强度的变化求导,反应条件优化,标准曲线分析 扩增效率：90%-110%，目的基因尽可能接近内参基因,反应条件优化,Master Mixture的选择,反应条件优化：-荧光定量Master MixtureDNA聚合酶荧光染料BufferdNTPROX#CW0956 UltraSYBR Mixture#CW0958 Fast SYBR Mixture#CW0932 GoldStar TaqMan Mixture,Master Mixture的应用,热启动
10、酶化学修饰，常温下完全没有聚合酶活性，热复活需95 10分钟-GoldStar、HotStar非化学修饰（Oligo修饰、抗体修饰、Mg2+螯合物）热复活仅需95几十秒-FastStarBuffer反应增强剂-减少引物二聚体，进一步提高反应特异性-对于复杂模板，提高反应效率稳定剂ROX or Without ROX?需参照仪器要求选择,反应体系优化：-误差控制使用Master mix配置预混体系设置 生物学重复（不同个体）技术性重复（复孔）阴性对照,反应体系优化,target gene目的基因,reference gene内参基因,total RNA,cDNA,total RNA,cDNA,t
11、arget gene目的基因,reference gene内参基因,qPCR,qPCR,数据分析,荧光定量PCR实验流程,普通小鼠,转基因小鼠,相对定量数据分析,2-Ct法,目标基因的Ct值-内参基因的Ct值 待测样本的Ct值-对照样本的Ct值 计算表达水平比率：2 Ct=表达量的比值,主要内容,33,荧光定量PCR原理荧光定量PCR实验流程荧光定量PCR产品与技术服务,荧光定量PCR相关产品,RNA提取,逆转录,荧光定量PCR,Super RT逆转录酶HiFi-MMLV逆转录酶第一链合成试剂盒一步法RT-PCR试剂盒,RNA样本保存液TRIzon超纯RNA提取试剂动物组织/细胞、植物、血液、
12、细菌、酵母系列专用RNA提取试剂盒,UltraSYBR MixtureFastSYBR MixtureGoldStar TaqMan MixtureRT-qPCR二步法试剂盒RT-qPCR一步法试剂盒,荧光定量PCR系列产品,DNA提取,荧光定量PCR,植物基因组提取试剂盒动物组织、细胞基因组提取试剂盒血液基因组提取试剂盒土壤微生物基因组提取试剂盒粪便基因组提取试剂盒病毒DNA/RNA提取试剂盒,UltraSYBR MixtureFastSYBR MixtureGoldStar TaqMan Mixture,Housekeeping gene 引物序列？反应条件？目标基因 引物序列？反应条件？
13、选择试剂，摸索条件，优化参数 两个月？CoWin解决方案：全套qPCR服务客户指定：物种，housekeeping gene，目标基因客户提供：生物样本客户得到：数据报告，剩余样品。客户下游工作：写论文;得诺贝尔奖,荧光定量PCR技术服务,荧光定量技术服务项目,技术服务流程,客户填写信息采集单康为与客户签订项目定制单康为按双方签定的定制单进行实验康为提供实验报告,荧光定量PCR信息采集,39,实验目的：用荧光定量PCR（SYBR Green法）法检测不同样本中OCT基因的表达差异。信息采集：（客户填写信息采集单）样本：名称、数量（人？大鼠？小鼠？）检测指标（几个基因？基因名称？）定量方法：相对
14、定量？绝对定量？检测方法：染料法？探针法？其他相关信息,荧光定量PCR实验方案,实验方案：（制定项目定制单）,荧光定量PCR实验报告,实验报告：（向客户提交完整实验报告）实验材料：（样本、试剂、仪器）实验方案：实验结果：RNA提取：RNA电泳图Real-time PCR：预实验结果：标准曲线、融解曲线正式实验结果：扩增曲线、融解曲线,荧光定量PCR实验报告,RNA电泳图：,Real-time预实验引物筛选结果,两对引物筛选结果对比,荧光定量PCR实验报告,Real-time 正式实验：,各样品相对定量分析结果：2Ct法,荧光定量技术服务优势,荧光定量PCR康为世纪拥有五台世界主流的荧光定量PC
15、R仪。ABI7500（两台）、ABI7900、Roche480（两台）免费设计、优化引物，荧光定量PCR反应扩增效率达到90%以上，相 对定量结果更可靠。成熟的700余种目标基因引物筛选库，24种内参基因引物，6种miRNA内参基因引物。共承接荧光定量PCR技术服务检测基因700余个，样本3000余个，物种包括人、大鼠、小鼠、豚鼠、猪、鸡、鸭、兔子、绵羊、山羊、黄瓜、西瓜、番茄、月季花、龙眼、荔枝、小麦、链霉菌、细菌、土壤、斑马鱼和杨树等20余种。,北京康为世纪生物技术有限公司总机：010-588519194006-222-360 订购 010-58851919-618 O 技术支持 010-58851919-615/616 市场部 010-58851919-628,
