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1、第二讲 农药残留分析实验室的良好操作规范（GUIDELINES ON GOOD LABORATORY PRACTICE IN RESIDUE ANALYSIS,GLP CAC/GL 40-1993,Rev.1-2003）,本 讲 座 内 容,2.1 前 言2.2 分析人员2.3 基本资源2.4 分析工作,2.1 前言,本准则旨在确保国际食品贸易检验获得的农药残留最大限量结果的可靠性。因为可靠的测定数据对于保护消费者健康、促进贸易公平进行至关重要。除本准则外，由国际食品法典农药残留分析委员会CCPR制定现行有效的与农药最大残留限量有关的其他准则如下：会在第八讲中提及。,2.2 分析人员,残留分析
2、由一系列的操作步骤组成，由于被测物浓度一般在 mg/kg 或 g/kg 水平，且被测物可能比较复杂并存在于各种各样的基质中，因此一定要注意很多细节问题。分析人员应具有一定的专业水平，并且在残留分析方面有丰富的经验并掌握熟练的技术。分析人员在使用仪器、实验室技能、处理和评价数据等方面要经过严格的培训。,国际贸易的公平进行主要依赖于可靠的分析数据。在农药残留分析中,不仅依赖于可靠有效的分析方法，还与工作人员在农药残留分析方面的经验及是否遵循农药残留分析实验室良好操作规范有关。保护消费者的健康和确保食品贸易的公平进行protecting the health of the consumers and
3、 ensuring fair practices in the food trade,分析人员要了解农药残留分析准则和分析质量保证(AQA)体系。了解分析方法中各步骤的目的、严格按照说明分析，特别要注意所有可能产生偏差的地方。同时做好实验记录。残留分析实验室建好后，分析人员应在仪器完备、具备指导经验和练兵条件的实验室培训一段时间。如果建立的实验室检测农药残留范围很广，分析人员需要到多个实验室进行考察并培训。,2.3 基本资源,2.3.1 实验室 2.3.2 设备和供给,2.3.1 实验室,实验室设计必须保证分析工作在安全环境下进行，同时要求该环境下样品被污染的可能性最小。样品的接收和储存、样品
4、制备、样品提取和净化、检测所用仪器最好在相互独立的实验室中。用于提取和净化的溶剂、试剂必须要符合残留分析要求。样品的接收、储存和制备必须在专用于残留分析的实验室内进行。,实验室安全要根据本国、本实验室的情况制定，必须认识到世界上某些残留实验室苛刻的工作条件在其他实验室是不切合实际的。只有少量的溶剂可以放在工作区域，大批量的溶剂要单独储存，且远离主要工作区域。尽可能少地使用具有高毒或慢性毒害的溶剂和试剂。废弃溶剂要安全储存，并按照国家法规处理，不能对环境造成污染。,提取、净化和浓缩应在通风良好的实验室内进行，最好在通风橱内进行。禁止在实验室内吸烟、吃东西、喝水或可能产生污染的化妆。玻璃器具在真空
5、或高压下使用时，必须使用安全遮板，采取防爆措施。实验室应有突发事件处理装置，有足够的可用灭火器。有些农药剧毒或慢性毒害，因此，在处理标准物质时要十分小心。,2.3.2 设备和供给,细微的变化可能会显著地影响测定数据的准确度。因此，色谱仪、天平、分光光度计等仪器要定期的维修、校准和检定，同时做好每种仪器的使用、维护、维修保养记录。冰箱和冷冻箱温度要经常监控，或在一定时间间隔下检查。所有的记录都必须随时更新，同时要保管好记录。要有稳定的水源、电源和气源。各种耗材的及时供给和质量保证。,实验室要有已知含量、高纯度的农药标准物质。样品中残留的母体化合物和最大残留限量中包括的该化合物的代谢物都应有标准品
6、。标准物质、储备液、试剂要贴上标签。标签上应包括日期、定值、溶剂、储存条件等信息。易降解农药要注明有效期。标准物质应储存在使其降解速率最小的条件下。要避免贮备液在光和热作用下分解，或因溶剂挥发而浓缩。,2.4 分析工作,2.4.1 样品的接收与储存 2.4.2 标准操作程序(SOPs)2.4.3 分析方法确认 2.4.4 仪器性能检验 2.4.5 确证试验 2.4.6 质谱分析 2.4.7 衍生化 2.4.8 最低校准浓度(LCL),农药残留检测与常量分析显著不同的是容易受到污染影响。用于检测的待测样被痕量污染就可能会产生很大的误差，或者使灵敏度降低导致残留不能检出。玻璃器具、试剂、有机溶剂和
7、水在使用前必须通过空白实验检测并证实其可能存在的干扰污染物。试剂和吸附剂必须纯化，最好使用重蒸馏溶剂、二次蒸馏水。,用于痕量分析的玻璃器皿要单独放置，且不可用于其他用途。农药标准物质要储存在与主要残留分析实验室分开的室内。储备液和样品提取液也不能储存在同一区域。农药残留分析和制剂分析必须有相互独立的实验仪器。为避免交叉污染，样品制备与残留检测应在不同的实验室内进行。,污染影响大小因所用检测技术和测定的残留农药的水平而不同。GC和HPLC方法中有严重影响的污染在分光光度法中却不明显，反之亦然。对于较高浓度的残留，来自溶剂和其他材料的背景干扰与残留含量相比可能就可以忽略。许多问题可以通过使用替代检
8、测器消除。如果污染不干扰残留测定，其存在是可以接受的。,2.4.1 样品的接收与储存,样品的接收：接收的样品应提供样品来源、分析要求、潜在毒性等信息。接收样品时，应同时给样品指定唯一标识，这个标识跟随样品分析的所有步骤直至发出检验报告。同时做好样品接收记录。样品处理和副样提取应按照说明提供代表性分析部分或部位且被测物浓度不发生变化。,样品的储存：样品不能立即分析，但能够尽快分析时，应将其储存在15 下,远离日光直射。接收的样品如果在冷冻状态下，在分析前要保持在-16环境下。样品需要储存较长时间，储存温度应在-20左右。必须进行长时间储存时或怀疑被测物可能分解，要使用添加样品考察其影响水平。,2
9、.4.2 标准操作程序(SOPs),标准操作程序应用于所有的操作步骤。标准操作程序除了包含系统适用性、预期效果、内部质量控制（性能测试）条件以及结果的计算信息外，还应包括所有的操作说明。同时包括来自分析方法、标样和试剂的所有潜在问题。与标准操作程序有关的所有偏差都要记录，且偏差要通过实验室负责人的认可。（类似实施细则）,2.4.3 分析方法确认,本准则规定了不同目的分析方法的确认程序。分析人员要确定某方法适用于预定目的的程度，还要提供必要的方法确认数据。分析方法包括从接收样品至获得最后测定结果的一系列程序。方法确认是确定某方法适用于预期目的的程序。分析方法可能是本实验室获得的，也可能是从文献或
10、其它途径获得的。,为了与实验室的要求和能力以及测定目的相匹配，选择的分析方法可能需要修正。方法的确认要伴随方法修正的整个过程。方法确认和应用要在所用检测系统的测定范围内进行。通常，方法确认在方法应用到样品测定前完成，但在随后的方法使用中各项分析参数检验也相当重要。分析参数检验是方法确认的一部分。,重复性测试（或实验室协同研究）是检验某方法结果总体准确度一个很重要的方法，同时还可提供实验室间结果的相对标准偏差。但是，重复性测定不能说明被测物的稳定性、均匀性和提取效率。需要提供不确定度数据时，应包括分析参数数据，而不能仅仅依赖于方法确认的数据。,实验室采用了某分析方法或修正方法后，要确定分析参数对
11、测定的影响，严格控制方法中影响测定结果的所有方面。如：样品大小、净化系统性能变化、试剂或制备衍生物的稳定性。溶剂、进样器、分离柱、流动相性质(组成和流速)、温度、检测系统、共提取物等对测定系统的影响。准确的建立响应值与被测物之间的定性、定量关系非常重要。,应优先选用多残留分析方法。使用代表性的样品在方法确认中非常重要。因此，样品的筛分要充分。一般地，某产品的某一品种可以代表该产品的其它品种。但是，水果或蔬菜类的单个产品不能代表整体。已知某产品的某一品种与其它品种对于同一分析方法响应不同时，这些品种就要进行单独分析。不同品种之间的方法准确度和精密度可能会有很大差异。,经验表明，相似的样品在提取和
12、净化上相类似时，可以采用简化方法进行方法确认。某产品的方法确认数据可以应用至其它产品举例：谷物：用于谷物的方法确认数据不能用于糠及粮食，但用于小麦的方法确认数据可用于大麦和小麦粉。水果和蔬菜：用于新鲜产品的方法确认数据不可用于干果，但是用于甘蓝的方法确认数据可用于抱子甘蓝。,代表性物质可用于方法性能的评价。需要选择具有与待测样品相同物化性质的样品。代表性样品的选择要基于以下几点：（a）选择的代表性产品要：.包含待测样品的所有物化特性。.必须是在常规条件下可测，或者是 鉴定结果以测定结果为基础的样品。,（b）用于最初方法确认程序的所有分析样品应是常规条件下可测的，同时所有样品必须能够同时测定。（
13、c）用于表征某一方法的分析样品浓度应当包括样品中全部待测样品的允许限（AL）。因此，选择的代表性分析样品应包括分别含有最高允许限和最低允许限的样品。从而，性能测试中代表性分析样品的添加水平可以不与真实的允许限值一致。,如果有合适的数据可以利用，分析者就不必进行全部的测试项目。但是，方法确认记录中必须包括或提及所有必需的信息。要评价的参数限定在对方法和特定方法应用目的都适用的范围内。很多情况下，与多个参数相关的性能特征可以在同一实验中获得。几个因素同时改变的实验设计（正交实验设计）可以减少原料的消耗。,单残留分析方法：使用待测的所有被测物或用于实验室检测的具有代表性的样品进行方法确认试验。组分析
14、方法：使用一个或多个代表性样品和从总体中选取的两种以上代表性被测物质进行方法确认试验。多残留分析方法：使用代表性样品进行方法确认试验。,2.4.4 仪器性能检验,性能检验的主要目的有：分析方法使用时，在真实操作条件下监控方法性能。考虑不可避免的因素，如样品组成、仪器性能、化合物纯度、工作人员和实验室环境条件的变化对检测的影响。说明方法检验中仪器等性能大致类同于确认方法中确定的性能、该方法在统计控制状态下、方法的准确度和不确定度满足要求。方法在应用时，方法确认获得的数据可能要根据性能检验所得数据修正。,质量控制结果可以提供方法的长期重现性和其它性能特征的重要信息。为了进行有效的性能检验，样品应与
15、合适的质控样品（空白样品、添加回收样品、标准物质等）同时测定。控制图可用于监测方法性能的变化趋势，并确保测定方法系统处于统计控制状态下。控制图是质量评定技术的主要方法。,控制图的组成和使用,控制图对于说明方法的性能和方法参数的重现性是非常有用的。大量相同类型的样品需要分析其活性成分时，控制图根据方法使用时所得平均回收率和标准偏差的数值制定。使用多残留分析方法对每一类样品中的少量几个进行分析，以测定其中的多种组分时，初始控制图由代表性样品中的代表性被测物质的平均回收率（Q）和实验室特征重现性系数（CVLtyp）组成。,该控制图的绘制如下所述：由方法确认所得单个分析组分的平均回收率数据和变异系数没
16、有显著差异时，每一个数值可认为是方法的真实回收率和精密度的估计值，通过适当的组合得到方法的特征回收率（Qtyp）和变异系数（CVAtyp），并用于建立初始控制图。警戒限和控制限分别为：Qtyp2CVAtypQ Qtyp3CVAtypQ。,典型的控制图有x和 控制图，有R控制图或S控制图（精密度控制图）。常把（或x）控制图与R（或S）控制图上下并排画在一起，如下图，控制图中有些点向上偏，甚至超出控制限，但在R控制图中点分布是正常的，这说明测量系统的精度没有什么变化，而是产生了某种争得系统误差。,方法使用时所得重现性数值可略高于方法确认中获得的数值。因此，如果有部分回收率的数值在警戒限外或偶尔在控
17、制限外，但均在指定的变异系数范围内，就不必进行其他附加的测定。方法应用时，作为性能检验的一部分，另外1520个的回收率测定值的平均回收率或特征回收率和变异系数的数值重新计算以组成一个新的控制图，这一控制图反映方法应用的长期重现性。,在方法应用中，如果测定的某组分最初10个以上的回收率平均值与代表性样品所得平均回收率有显著性差异（P=0.05），那么Qtyp和CVAtyp的数值是不合适的。重新计算特定被测物新的警戒限和控制限，以用于新的平均回收率和CV值的测定。如果性能检验的数据重复的落在警戒限外（1/20的测定结果落在警戒限外是可以接受的），需要检查方法的条件，确定误差的来源，在方法继续使用前
18、采取必要的校准措施。,如果性能检验的数据落在控制限外，所分析的样品要重新测定。重复性测定是性能检验的另一个有效措施，这一结果可用于计算方法的总体实验室重现性（CVAtyp）。这种情况下，总体实验室重现性也包括样品测定中的不确定度，但是该测定不能说明被测物质是否在测定过程中丢失。,2.4.5 确证试验,分析以监测或执法为目的时，确证样品中含有某种农药或是否超过最大残留限量的工作特别重要。原因是样品中含有的干扰物质可能被作为农药造成误判。例如，气相色谱中电子捕获检测器对酞酸酯化合物的测定、选择型性磷检测器对含硫与氮化合物的响应。,确证试验可能是定性分析，也可能是定量分析。但多数情况下，这两方面的信
19、息都需要。残留检测在检出限或检出限附近时，确证试验就非常困难。但是，仍需提供足够的定性和定量信息。,确证实验的要求随样品类型和该样品已知信息而定。对于相同来源的含有相同农药残留的一系列样品来说，随机选取少量样品就能够对农药进行定性。同样地，如果已知某特定的农药应用到某种样品中，尽管随机选取得样品的测定结果需要确证分析，也没有必要对农药进行定性确证实验。空白样品的分析是必要的，它可用于检测是否存在干扰物。,基于最初的测定方法，其他某种可替代的检测方法对样品的定量可能是必要的。对定性分析，可以使用质谱或基于样品物化特性的某种组合技术。取得可靠确证数据的关键是对分析部分的正确判断，同时应特别注意要选
20、择一种将干扰化合物的影响降至最低的方法。所选的技术应以实验室具备的仪器和可用技术为基础。,2.4.6 质谱分析,使用质谱获得的残留数据是最可靠的。农药残留质谱测定通常与色谱分离技术联用，以同时提供保留时间、质荷比和离子丰度信息。特定的分离技术、质谱技术、两者的联用、被分析农药的范围是相关的。没有一种组合可以分析所有的化合物。某种农药残留存在最可靠的证据是获得该农药的完整电子轰击质谱图。,提高灵敏度可以通过缩小扫描范围或选择离子扫描实现，但是离子数目越少，得到的数据结果就越不准确。其它的确证信息可通过以下方式获得：更换色谱柱；使用其它的离子源技术；通过使用串联质谱监测选择离子的进一步降解产物；通
21、过监控选择离子提高质谱分辨率条件。对于定量分析，监控离子应是所分析化合物的特征离子，同时要求干扰最小并能产生良好的信噪比。,一般情况下，高效液相色谱检测数据比气相色谱可信度差，如果该农药有紫外吸收，完整的紫外光谱图可以提供较充分的定性依据。然而，一些农药的紫外光谱图很难判断，因为其光谱图与许多具有相似官能团或结构的其他化合物产生的光谱图相似。一般情况下，紫外吸收数据是不足以定性的。荧光检测数据可用于确证紫外吸收获得的数据。,单极液质联用可以提供较多的定性依据，但是由于产生的质谱图一般都比较简单，只能得到很少的特征碎片，因此其结果可信度不大，LC/MS/MS联用是更强有力的分析技术，可以提供足够
22、的定性依据。单极液质联用技术易受基质的影响，因此定量分析可能需要使用标准添加物质或同位素标记标准品。,某些情况下，气相色谱法所被测物质的定性可以通过薄层色谱法很容易地完成。定性确证主要依据两个参数：比移值和显色反应。基于生物催化剂的检测方法适用于某些特定类型农药的定性。然而，薄层色谱分析在定量方面的应用还是有限的。薄层色谱法的优点是快速、成本低、便于分析热不稳定农药，不足是与色谱检测技术相比，灵敏度低、分离效果差，检测依据化学显色反应要求更有效的净化技术。,2.4.7 衍生化,2.4.7.1 化学反应 通过化学反应使农药样品发生降解、聚合或缩合，然后利用色谱技术对样品进行再测定。反应使样品具有
23、与原化合物不同的保留时间或响应。农药标准品要与可能含有残留的样品一起处理，以便于结果的直接对比。测定衍生物时，衍生化试剂的性质可能会对测定产生干扰。,该部分的确证实验可分为以下三类：,2.4.7.2 物理反应 对农药残留物发生光化学反应以产生的一种或多种光解产物进行色谱分析是一种可用的技术。农药标准品和添加样品要用相同的方法处理。含有多种农药残留的样品可能会给结果的解释带来困难。这种情况下，在衍生化反应前，可以事先通过薄层色谱法、高效液相色谱法、柱层析法对残留物进行分离。,2.4.7.3 其他方法 许多农药对酶敏感，可以被其降解或转化。与通常的化学反应不同，这些方法具有特异性，通常包括氧化反应
24、，水解反应或去烷基化。转化后的产物具有与农药亲体不同的色谱特性，将农药标样与反应产物对比即可用于确证试验。,2.4.8 最低校准浓度(LCL),以监控和检验与是否符合最大残留限量或其他允许限为分析目的时，检测方法必须足够灵敏以准确地测定在农作物或环境样品中是否含有在MRL或AL水平上的农药残留。然而，使用灵敏到可以检测比该水平低两个或更多个数量级残留的方法是没有必要的。可以测定很低水平残留的分析方法成本非常昂贵，也很难应用。最低校准浓度的应用可以降低获得数据的技术难度，而且可以降低成本。,对于符合农药最大残留限量的有效成分，最低校准浓度可根据农药最大残留限量指定。为了便于分析，这一数值是可变地
25、：MRL(mg/kg)LCL(mg/kg)5 或者更高 0.5 0.5-5 0.1，对于较高的MRLs可增至0.5 0.05-0.5 0.02，对于较高的MRL可增至0.1 0.05 0.5 MRL 当农药最大残留限量设定在分析方法的检出限时,最低校准浓度为检出限。,对于常规检测，只需要给出有效数据。无效数据低于检出限，而不是低于由外推法计算的某一水平时，该数据也应当给出。一般情况下，结果不应因回收率而修正，只有在回收率远离100%时可以修正。如果记录的结果是回收率修正后的，那么实测数据和修正后的数据都要给出。同时给出修正的依据。,有效数据来源于同一样品的平行测定时（如：不同的色谱柱、不同的检测器或离子源不同的质谱），应给出最低有效值。有效结果来源于多个样品的测定时，应给出每个样品最低有效值的几何意义。一般地，精密度浮动范围在20 30%时，结果保留两位有效数字。在较低浓度下，精密度浮动范围可能在50%，低于0.1的残留数据保留一位有效数字即可。,检测方法确认框图,被测物稳定性的确定,
