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1、第二章 生物制药工艺技术基础Basis of biopharmaceutical technology,第 一 节生化制药工艺技术基础,一、生物材料的来源与选择（一）生物材料的来源：（二）生物活性物质存在部位：胞内、胞外、胞浆、质膜、器膜、周质（三）生物材料的采集：1、品种鉴定 2、防止污染与感染 3、选择富集目的物材料（四）保存方法 冷冻法、有机溶剂脱水法、防腐剂保鲜法,二、生物活性物质物质常用的提取方法与优化,（一）几种常用提取方法 1.酸、碱、盐水溶液提取方法 2.表面活性剂提取方法与反胶束提取方法 3.有机溶剂提取 4.双水相萃取法 5.超临界萃取法,（二）提取方法与优化1.溶剂选择2
2、.选择添加剂 保护剂 酶抑制剂3.提取条件 温度 pH 盐 表面活性剂,三浓缩与干燥,1.浓缩方法 盐析 有机溶剂沉淀 高分子脱水（葡聚糖凝胶和聚乙二醇浓缩）超滤 真空浓缩或薄膜浓缩,（书P45页）,旋转蒸发仪,2.干燥：低温真空干燥喷雾干燥冷冻干燥,（书P47页）,真空干燥器,四、分离纯化,1.生化制药工艺中分离纯化特点(1)生物材料组成复杂(2)目的物含量低(3)易变性、失活(4)分离方法有很大经验成分(5)步骤多，逐级分离(6)产品验证与化学上纯度概念不完全相同,(书P49页),2.分离纯化原理 P49页(1)根据分子形状与分子大小(凝胶层析）(2)根据电荷差异（离子交换树脂法）(3)根
3、据分子极性与溶解度大小（萃取法、固相层析法）(4)根据吸附特性（吸附分离法）(5)根据生物配基特性（亲和层析法）,3.选择原则（1）粗品分离：大处理量,相对低分辨率 盐析，分级沉淀，萃取，超滤（2）精制：高分辨率 多种色谱层析法,亲和层析，HPLC，电泳或等电聚焦,第 二 节 微 生 物 制 药 工 艺 技 术 基础,一、菌种的选育与保藏1自然选育 依据自发突变原理，通过不断分离筛选，除去衰变菌落，选择高产菌，达到强化、复壮、稳定生产目的 方法：（1）平板划线法（2）稀释平板法,2.诱变育种：定义（书52）（1）出发菌株的选择 稳定性 具备某种优良性状的菌株 对诱变剂敏感 生理状态及生长时间（
4、2）诱变处理 化学诱变 物理诱变 生物诱变（3）筛选：随机筛选；半理性化筛选,突变株筛选一般进程如图所示,第三第四轮同第二轮,第三第四轮同第二轮,3.现代菌种选育技术 杂交育种 原生质体融合 基因工程技术(P55页),4.菌种保存,（1）保存目的：防止退化（2）菌种退化检查方法（3）菌种退化防止方法 防止基因突变：如低温保藏 采用双重缺陷型 制作平行的菌种斜面，少传代 分离单菌落，自然筛选 选择培养条件,（4）菌种保藏方法：斜面低温保存 液体石蜡封藏法 甘油冷冻法 冷冻干燥法 液氮保藏法,二、发酵工程技术基础,发酵工程：单细胞纯培养工业化过程，以产生大量目的物。纯培养：从一个单细胞微生物取得的
5、后代培养称纯培养。液体培养深层发酵 固体培养浅盘培养,（一）微生物生长的六大营养要素 碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐、水（二）培养基 合成培养基 天然培养基,（三）发酵过程的控制1、主要控制参数：物理、化学、生物2、发酵过程的变化规律：分批发酵、补料分批发酵、连续发酵3、发酵过程的优化,发酵设备：空压机、种子罐、发酵罐，蒸汽发生器、空气过滤器、离心机及多种参数控制与检测设备，以L-Lys生产设备为例，见图1所示,图1 L-Lys生产过程工艺设备图,第三节 生物技术药物制造技术基础,1.基因工程药物制造程序,一、基因工程制药（重组DNA）技术基础,2.上游技术基因工程操作过程（1）获得目的基
6、因（2）构建DNA重组体（3）将重组体导入宿主细胞（4）工程菌的克隆与鉴定（5）目的基因扩增与蛋白表达,二、酶工程制药技术基础,1.酶工程(enzyme engineering)研究内容酶的发现、分离纯化与生产应用酶与细胞的固定化技术与酶反应器生物酶工程：以基因工程技术和蛋白质工程技术研究酶工程抗体酶、模拟酶、合成酶及酶的人工设计,（书P102）,图 酶反应示例,2.固定化酶(immobilized enzyme)：定义见书102（1）固定化稳定性提高（2）可重复使用、提高使用效率、降低成本（3）提高强度，便于连续、自动、规模化生产（4）便于产物的分离、纯化,固定化反应器,酶的固定化技术和固定
7、化酶,3.固定化酶的制备方法（1）吸附法：分为物理吸附法和离子交换吸附法（2）包埋法：将酶或细胞定位于凝胶高聚物网络中，如卡拉胶，海藻胶，聚丙烯酰胺（3）共价键结合法：酶分子与载体分子，通过化学偶联使酶与载体共价结合。（4）交联法：用双功能试剂 将酶与载体交联固定化,图:酶固定化方法示意1.离子结合 2.共价结合 3.交联4.聚合物包埋 5.疏水作用6.脂质体包埋 7.微胶囊,第四节 生物制药工艺中试放大设计,一、中试放大目的与规模,1.目的（1）建立稳定工艺、大批量制备足量合格产品，供应临床前与临床研究（2）研究工艺参数制定工艺规程和检定规程，为正式生产提供工艺参数，保证能在以后生产中应用,
8、2.规模 中试是由小试转入工业化生产的过渡性研究，是取得成功产业化的关键,3.中试放大时应具备的条件（1）有稳定的工艺：收得率和质量可靠（2）操作条件基本确立（3）已建立中间品和成品分析方法（4）生物材料已鉴定（5）物料平衡、三废处理已基本解决（6）中试规模、产品产量，规模已确定（7）安全生产已有方案,4.中试放大要解决的问题（1）原辅材料规格（2）设备选型与材质选用（3）反应条件（4）原辅料中间品、产品质控标准与检定方法（5）下游工艺优化与稳定制造规程的制定,二、中试放大方法与总结内容,1.放大方法（1）经验放大（2）相似放大（3）数学模型放大2.总结内容（1）确定工艺路线，优化工艺条件，制
9、定制造规程（2）制定岗位操作、投产（3）进行材料衡算（4）安全生产与处理（5）原辅料及产品质控方法与标准测定（6）产品规格标准制定（7）消耗定额，成本核算，工时，生产周期计算,第五节 生物制药工艺技术若干进展,一、21世纪的热门生物技术,1.组合生物合成 组合生物合成(combinatorial biosynthesis)或组合生物学(combinatorial biology)是指应用基因重组技术重新组合微生物药物的基因簇,产生一些新的非天然的基因簇,从而合成许多新的非天然的化合物,为生物药物的筛选提供丰富的化合物资源,微生物药物通常是由非常简单的化学物质,如小分子羧酸或某些氨基酸作为合成起
10、始单位和延伸单位合成的,参与合成的酶为一系列基因编码的多酶体系(构成一个合成途径)。研究表明,参与这类小分子生物合成的基因通常是连锁或邻接而构成一个基因簇(cluster),这为基因的克隆和操作提供了方便,同时由于参与次级代谢生物合成酶系对底物的特异性,专一性要求不是很严格的,对结构相类似的底物均可识别,这一特点为不同基因组合产生新的化合物创造了条件,组合生物合成技术在药物研发中的应用,酮基合成酶(KS)、酰基转移酶（AT）、脱氢酶（DH）、烯醇还原酶（ER）、酮基还原酶（KR）和酰基载体蛋白（ACP）等功能域,组合生物合成技术示意图,酶 1,酶 2,酶 3,化合物 A B C D,酶1 基因
11、,酶2 基因,酶3 基因,基因克隆,A,D,质粒,转移至宿主菌,酶或蛋白质,2.药物基因组学 是一门研究个人的基因遗传如何影响身体对药物的反应的一门科学。由对基因的研究发现带有某种特定基因的人，会对某种特定的药物成份，产生某种特定的反应。将这个基因、药物成份与服用后反应的一连串关联，运用在用药之上，就可以知道带有某特定基因之人，不适合服用含有某特定成份的药物，进而降低药物副作用产生的风险；反之，也可以知道带有某特定基因之人，特别适合服用含有某特定成份的药物，进而提升治愈疾病的机率,3.药物蛋白质组学 4.蛋白质工程 5.基因治疗与基因疫苗 6.糖基化工程 7.先导物高通量筛选与药物合理设计（r
12、ationaldrug design）8.核酶、抗体酶、干扰RNA 9.药物生物信息学 10.功能抗体与人工智能技术和虚拟人技术,二、蛋白质工程与蛋白质的分子设计,蛋白质工程：在基因水平上设计表达新的功能蛋白 1.产品的特点（1）改善稳定性（2）提高生物活性（3）延长体内半衰期（4）降低免疫原性,2蛋白质工程研究基本程序,3.基因改造技术（1）基因定点突变技术（2）DNA改造技术（DNA Shuffling）（3）定向进化技术(directed evolution)（4）融合蛋白表达（5）改变糖基化位点,DNA shuffing图,三、蛋白质组学1蛋白质组学：研究细胞、组织或个体全部蛋白质的表
13、达状态与功能状态是后基因组时代的重要研究方向，我国已承担肝脏蛋白质组学的10%研究工作。2其研究平台，包括四大部分（1）样品制备（2）双向电泳（3）成象分析（4）自动切取蛋白及微量质谱分析，信息处理,双向电泳工作流程如下,3.应用（1）鉴定与疾病相关的专一性蛋白（2）候选靶点的鉴定与确立（3）药物作用靶点与药物作用有效性和信号 转导的分析（4）药物作用与蛋白质组的作用模式（5）研究药物代谢与不良反应、毒副作用的酶谱，提供病人分类，实现个性化用药,四、转基因动物制药,1.将外源基因导入哺乳动物的受精卵或胚胎中，使导入基因与受精卵染色体整合，并将外源基因稳定性地传给子代，使子代表现外源基因的性状 2.转基因动物的方法（1）DNA显微注射法（2）胚胎干细胞法（3）反转录病毒感染 3.应用成功实例：乳铁蛋白、-AT(抗胰蛋白酶)，tpA，因子，protein c等(转基因动物乳腺反应器)。,作业,1、名词解释：诱变育种、原生质体融合、固定化酶2、简答题（1）生物药物分离制备的基本特点有哪些？（2）简述生物活性物质分离纯化的主要原理。,
