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1、第十二章 免疫检测原理及方法,第十二章 免疫检测原理及方法,免疫检测技术对于基础和临床兽医学发展以及在疾病诊断、预防和治疗以及研究疾病起因、发生和发展的方面都有着极其重要的意义。免疫学技术的改进和发展，是建立在许多其他生物科学的技术之上，如用生化和蛋白分离技术分离抗原和抗体、用分于遗传学技术闸明免疫学上重要分子的基因序列。另一方面，免疫学又形成了许多本学科的技术，尤其是依据于抗原-抗体反应有高度特异性，作为检测手段胜过任何其他方法在这方面的优势。,第一节 抗原或抗体的体外检测,抗原与相应抗体在体外可以发生特异性结合，由于抗原的物理性状及参加反应其他辅助物质的不同，抗原和抗体结合后可出现凝集、沉
2、淀、补体结合等反应。对这些现象进行分析、观察，可鉴定抗原或抗体。用已知抗原检测未知抗体，也可用已知抗体检测未知抗原。由于试验时要用血清作为试验材料，所以这种抗原抗体的试验方法常称为血清学反应或血清学试验。现在由于抗体纯化技术及单克隆抗体技术的建立与应用，抗体不一定都来自血清，血清学试验一词的应用范围已不如以往普遍了。,一、抗原抗体反应总论,(一)抗原一抗体反应的特点 1.高度特异性 2.表面的结合 3.一定比例范围内结合 4.结合反应分两个阶段(二)影响抗原一抗体反应的因素 1.电解质 2.温度 3.pH值,二、抗原-抗体反应的基本类型,由于新技术不断出现，抗原-抗体反应种类繁多。尽管如此，基
3、本类型主要还是凝集反应、沉淀反应、浊度反应、补体介导反应和中和反应。上述反应的抗原特点、抗体名称、辅助条件、表现形式以及方法的敏感度各不相同。近年来，在上述基本反应基础上，采用荧光素、同位素和酶标记技术，使抗原-抗体反应敏感度增加1,000倍以上。这种免疫标记方法已广泛应用到医学、兽医学以及其他生物学许多领域中。,二、抗原-抗体反应的基本类型,(一)凝集反应 1.直接凝集反应玻片法、试管法 2.间接凝集反应 3.补体结合反应(二)沉淀反应 1.琼脂扩散试验 2.絮状沉淀法 3.环状试验(三)免疫比浊法(四)血清补体（CH50）的测定,双向扩散,单向扩散,免疫电泳,火箭电泳,对流免疫电泳,(五)
4、免疫标记技术,1.免疫荧光法 荧光素结合到抗体分子上，用荧光标记抗体浸染可能含抗原的细胞或组织切片，在荧光显微镜下可见发荧光物体，以此对标本中相应抗原进行鉴定和定位。(1)定性法直接法、间接法、补体法(2)定量法显微荧光光度计、流式细胞仪2.免疫酶标记法 用酶标记抗体(或抗原)，用酶的底物来显示抗原抗体反应，这种方法具有操作简便、安全，等特点。(1)ELISA直接法、简接法、夹心法、竞争法(2)酶联免疫电泳转移印迹法(Westerb-Blot)(3)斑点免疫结合试验(Dot-ELISA),3.放射免疫测定法 原理是待测抗原和标记抗原与定量的相应抗体发生竞争性结合。待测抗原是动物内的某种微量活性
5、物质，如细菌和寄生虫的可溶性抗原、激素类、细胞内信使如cAMP、cGMP和前列腺素E等。标记抗原是将已知的上述物质标记上放射性同位素(125I、131I 3H、4C、32P)。将标记抗原(Ag)和未标记抗原(Ag)按比例混合，再使两者与定量的相应抗体(Ab)发生竞争性结合，也即竞争抑制反应。,第二节 免疫细胞的检测,参与免疫应答的细胞有多种，如负责体液免疫的B细胞，执行细胞免疫的T细胞和沟通体液免疫和细胞免疫的其他细胞等。T细胞、B细胞表面具有特异性抗原和多种受体，据此建立了相应的检测方法，以鉴定和计数动物外周血液和淋巴样组织中的T细胞、B细胞及其功能。,一、免疫细胞的定量检测,(一)T细胞的
6、定量检测 检测T细胞数量最早和最普及的试验是红细胞花环试验，按花环阳性淋巴细胞百分率表示。目前，可通过检测T细胞表面CD抗原，了解外周血T细胞数量或亚群的变化。从外周血分离出富含的单个核细胞制合成适当数量的细胞悬液，分放在3个小试管中，分别用抗CD3、CD4和CD8的单克隆抗体作为第一抗体进行结合，再用FITC标记的兔小鼠IgG抗体作为第二抗体进行间接免疫荧光染色。可在荧光显微镜下或用流式细胞仪观察结果。,(二)B细胞数量的检测,B细胞表面有多种标志，如SmIg、IgG的Fc受体、补体受体等。通过检测SmIg，了解成熟B细胞的数量，将单个核细胞用FITC标记的兔抗免疫球蛋白作直接免疫荧光染色，
7、显荧光的细胞为SmIg+细胞，即B细胞。溶血空斑试验是体外检测抗体形成细胞的一种方法，即将经红细胞(RBC)免疫过的家兔淋巴结或小鼠脾脏制成细胞悬液，与一定量的RBC结合，于37作用下，免疫活性淋巴细胞释放出溶血素，在补体的参与下，使抗体形成细胞周围的RBC溶解，从而在每一个抗体形成细胞周围形成肉眼可见的溶血空斑。每个空斑表示一个抗体形成细胞，空斑大小表示抗体生成细胞产生抗体的多少。,三、淋巴细胞转化试验,当机体受到抗原(或丝裂原)的刺激时，T淋巴细胞就可以转化为淋巴母细胞，进一步转化为致敏淋巴细胞。这种转化在一定的程度上代表着机体的细胞免疫功能状态。这种转化也可在体外的T细胞的培养过程中加入
8、适当的刺激原而出现，并表现出形态上的变化。主要有两种方法：一是形态学检查法，即将加有PHA培养淋巴细胞后涂片、染色、镜检以观察形态学变化，计算淋巴细胞转化率；另一种是同位素标记物掺入法，即当淋巴细胞受分裂原刺激发生转化时，将具有放射性的3H-TdR(胸腺嘧啶核苷)加到培养液内，被DNA的原料摄入转化中的细胞内，测定细胞内放射性物质的相对数量(以脉冲数表示)，进而测定淋巴细胞的转化程度。,细胞毒性T细胞试验(Cytotoxic T lymphocyte test，CTL test)的基本原理是将靶细胞，如肿瘤细胞、病毒转化细胞等，与同种抗原致敏的淋巴细胞混合培养，然后检测靶细胞的死亡情况。细胞毒
9、性T细胞试验一下两种方法：(1)形态学检查法：根据体外贴壁生长的靶细胞被CTL杀伤后失去贴壁的能力，所以从贴壁细胞数目减少情况可判断CTL杀靶细胞的能力。(2)51Cr释放法：用铬酸钠(Na51CrO4)标记的靶细胞与致敏淋巴细胞一起培养，靶细胞被CTL杀灭后，51Cr即释放到培养液中，测定释放到培养液中51Cr的脉冲数(cpm)即反映出CTL杀靶细胞的程度。,四、细胞毒性细胞杀伤靶细胞的检测,第三节 细胞因子的检测,细胞因子检测包括生物学、免疫学和分子生物学测定三大类方法。1.生物学测定法，包括有3H-TdR掺入法、微量酶检测法和细胞计数法。用生物学方法测定细胞因子，使用最早，也最普及。2.免疫学测定法,包括免疫斑点法、ELISA、RIA和免疫印迹法等，优点是特异性和重复性较好，快速简便。3.分子生物学测定法,有RNA印迹怯、核酸酶保护分析、原位杂交和PCR等。该法敏感性高，可先于生物学和免疫学方法预知细胞的分泌情况。,
