【教学课件】第十四章病毒学总论.ppt

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1、第十四章病毒学总论,病毒(virus)的发现1892年发现第一个病毒即烟草花叶病毒1898年发现动物口蹄疫病毒首先被证实对人类有致病性的是黄热病毒（1901年发现）,病毒的特点：1、体积微小，必须用电子显微镜观察；2、只有一种遗传物质；3、必须在活细胞内显示生命活性；4、无完整的细胞结构。,病毒学:即研究病毒的本质、病毒与宿主相互作用和规律的生物学科。,医学病毒学:即研究人类病毒的本质及其与人类疾病关系的一门学科。,1、临床约70-80%传染病是由病毒引起的;2、病毒性疾病对人类健康危害极大;3、近20年来，新病毒不断被发现，由此引发的病毒性疾病正越来越多的被人们所关注.,第一节 病毒的形态结

2、构与分类,病毒体（virion)完整的具有传染性的病毒颗粒，有典型的形态和传染性。,1、测量单位纳米（nm）3、观察工具电子显微镜2、大多数病毒的直径小于150 nm,一 病毒的大小与形态,立克次体450nm,衣原体390nm,病毒的形态：多为球型，还有杆状、子弹状、砖块状及蝌蚪状等。,乙肝病毒,腺病毒,轮状病毒,狂犬病毒,子弹状的狂犬病毒,噬菌体,天花病毒,Ebola 病毒,HSV-2,二、病毒的结构与功能,核衣壳,裸病毒,包膜（envelope）:包绕在核衣壳外，上常有刺突（spike），是病毒的表面抗原。,辅助结构：,EBV结构模式图,1、病毒核酸,(1)化学成分为DNA或RNA，据此将

3、病毒分DNA病毒和RNA病毒。(2)核酸可线型或环型、分单股或双股，一般DNA病毒为双股，RNA病毒为单股；大小相差悬殊。(3)携带病毒的全部遗传信息，是病毒的基因组，控制病毒的生殖、遗传和变异。,2、病毒衣壳：由多肽构成的壳微粒组成，,有三种排列方式：,螺旋对称立体对称复合对称,病毒的几种对称类型（据壳粒排列方式所分）,螺旋对称型（helical symmetry),20面体立体对称型(icosahedral symmetry)：大多数球状病毒属之；,20面体立体对称型,螺旋对称型,（3）复合对称型(complex symmetry,3、病毒包膜,包膜（envelope）:包绕在核衣壳外，上

4、常有刺突（spike），是病毒的表面抗原。,包膜,4、病毒的蛋白质,结构蛋白：是组成病毒体的蛋白成分，可离心沉淀后分离纯化。（1）衣壳蛋白：（2）基质蛋白：（3）包膜蛋白：,非结构蛋白：可存在于病毒体内也可仅存在于宿主细胞内。（1）病毒内所有的重要的酶类；（2）抑制宿主细胞生物合成或抑制病毒抗原经MHC递呈的蛋白；（3）转化宿主细胞的作用；（4）抗细胞因子或抗细胞凋亡作用。,三、病毒的分类,分类原则：1、核酸类型和结构；2、病毒体的形状和大小；3、病毒体的形态结构；4、对脂溶剂的敏感性。,1、DNA病毒类；2、RNA病毒类；3、DNA和RNA逆转录病毒类。,三、其他：,1、卫星病毒(satel

5、lites):,基因组缺陷的病毒，,一类为可编码自已衣壳蛋白；另一为RNA分子，需要,辅助病毒的衣壳蛋白。500-2000核苷酸，引起植物病变,2、类病毒(viroids):,植物病毒，单链杆状RNA有二级结构，200-400核苷酸，,无包膜，不含蛋白质,3、朊粒(prion):,3.0104的蛋白质，引起疯牛病,第二节 病毒的增殖 遗传与变异,一、病毒的培养：,（一）动物接种 1、不同的病毒，易感动物不同，常用动物有：小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猴等；2、接种的途径也有多种，可：皮下、皮内、脑内、腹腔、静脉等接种；3、病毒动物动物出现感染症状，据症状鉴定病毒或取病变组织进一步检查。,（二）鸡胚培养

6、,1、接种途径有：尿囊腔、羊膜腔、卵黄囊、绒毛尿囊膜2、培养数天后，观察鸡胚情况或取培养物进一步鉴定,尿囊腔接种,羊膜腔接种,尿囊腔,羊膜腔,卵黄囊接种,绒毛尿囊膜接种,卵黄囊,绒毛尿囊膜,（三）组织培养（最常用细胞培养）,1、优点：（1）便于纯化病毒；（2）可直接观察细胞变化（包括细胞出现病变或转化）；（3）可对病毒的复制进行基础性研究；（4）可进行空斑纯化病毒克隆；（5）可滴定病毒含量。,2、细胞种类：（1）原代细胞：以无菌手续采动物等的组织切碎洗净后用胰蛋白酶消化得分散的单个细胞，加培养液在细胞瓶内培养所获得的单层贴壁细胞为原代细胞；原代细胞消化、重新分装并培养所得细胞为次代细胞。特点：

7、对病毒易感性高，主要作为自标本中分离的工具。,（3）二倍体细胞：在体外分裂50-100代后仍保持其二倍染色体数目的单型细胞，常用人胚肺二倍体成纤维细胞。,（2）传代细胞系：能在体外持续增殖传代的细胞系，多由癌细胞或二倍体细胞突变而成。,3、病毒在细胞内增殖的检查与鉴定,（1）观察细胞变化(cytopathic effect,CPE)：CPE病毒感染细胞后引起的细胞病变。,正常成纤维细胞,单纯疱疹病毒感染 后细胞变圆等,呼吸道合胞病毒感染 后形成多核巨细胞,（2）病毒的定量测定：TCID50(50%tissue culture infective dose)：将病毒进行系列稀释后行细胞培养，观察

8、能使半数细胞培养孔或试管内的细胞发生细胞病变（CPE）时的病毒量，即TCID50。,病毒感染细胞后形成嗜酸性或嗜碱性包涵体,狂犬病毒感染后在脑细胞的胞浆内出现嗜酸性圆形或椭圆形的包涵体，可供辅助诊断.,（一）病毒的增殖过程,增殖方式自我复制(selfreplication),复制周期：1、吸附和穿入(absorption and penetration)2、脱壳(uncoating)3、生物合成(biosynthesis)4、装配与释放(assembly and release),（一）吸附和穿入(absorption and penetration)吸附：病毒的表面配体位点与细胞表面特异性受

9、体结合；穿入：病毒进入宿主细胞。,吸附,胞饮方式穿入,（二）脱壳(uncoating)：病毒核酸游离于宿主细胞内。,病毒核酸,病毒核酸,（三）生物合成(biosynthesis)：,早 期：基因组在细胞内合成非结构蛋白（病毒复制酶及抑制细胞正常生物合成的抑制酶）。,晚 期：根据基因组的指令在细胞内复制病毒核酸合成结构蛋白和非结构蛋白,隐蔽期,根据基因组转录mRNA及转译蛋白质的不同，生物合成可分六大类：,1、DNA病毒（双链）：细胞核内合成DNA，细胞质内合成病毒蛋白。,依赖DNA的RNA多聚酶,早期mRNA,转 译,早期蛋白,药物作用的靶,晚期：,解链,正链DNA负链DNA,DNA多聚酶,子

10、代DNA,转录,晚期mRNA,晚期蛋白,病毒衣壳蛋白及其他结构蛋白,2、RNA病毒（单链）：多数在细胞质内合成子代RNA及病毒蛋白。,（1）正单链RNA病毒（有mRNA功能）：,正单链RNA,复制,子代RNA,结构蛋白（衣壳蛋白等）,非结构蛋白（依赖RNA的RNA多聚酶）,双链RNA（复制中间型）,药物作用的靶,（2）负单链RNA病毒（有依赖RNA的RNA多聚酶）：,负单链RNA,依赖RNA的RNA多聚酶,正单链RNA（有mRNA功能）,子代RNA,结构蛋白（衣壳蛋白等）,双链RNA（复制中间型）,药物作用的靶,解链,（3）逆转录病毒（有逆转录酶，即依赖RNA的DNA多聚酶）：,单链RNA,逆

11、转录酶,进入细胞核,整合（前病毒）,子代病毒RNA,病毒mRNA,病毒蛋白质,肿瘤发生,药物作用的靶,（四）装配与释放(assembly and release),裂解细胞后病毒释放出来,出芽释放,出芽释放,三、病毒增殖的细胞效应：,（一）损伤：1、无包膜病毒：阻断或抑制细胞正常代谢，裂解细胞；2、有包膜病毒：影响细胞功能及其正常代谢可致细胞死亡；有些则形成细胞间桥或引起细胞融合而致细胞损伤等。,2、产生原因：（1）第一种病毒感染细胞后使细胞表面受体或代谢途径发生变化；（2）病毒感染细胞后可诱导细胞产生抑制病毒复制的一组蛋白（干扰素，interferon，IFN）,（二）干扰现象(interf

12、erence)：1、概念：两种病毒同时感染同一细胞时，可发生一种病毒的增殖抑制另一种病毒复制的现象，即干扰现象。,四、病毒的异常增殖,1、缺陷干扰颗粒（defective interfering particles,DIP）,缺陷病毒（defective virus）：带有不完整基因组的病毒；当缺陷病毒不能复制但却能干扰同种成熟病毒体进入细胞时称DIP；具有两面性，一则干扰野毒株复制，二则在野毒株完整基因的辅助下可增殖出完整病毒。,2、顿挫感染（abortive infection）病毒进入宿主细胞后，由于细胞缺乏病毒复制所需的酶或能量等必要条件，使病毒在其中不能合成自身成分，或虽合成病毒核酸

13、及蛋白质，却不能组装成完整的病毒体，是为顿挫感染。,3、卫星病毒：基因组缺损的病毒,五、理化因素对病毒的影响一、物理因素 温度、PH、射线和紫外线二、化学因素 脂溶剂、氧化剂、卤素、醇类,六 病毒的遗传变异,（一）突变株：病毒基因改变而发生病毒生物学性状改变，该毒株若能稳定传代即为变异株（variant).,如：温度敏感突变株、宿主范围突变株、病毒毒力变异株、抗原性变异株等。,（二）重组与重配：将有亲缘关系的两种病毒感染同一细胞时，经相互作用后，病毒间交换核酸片段，发生基因重组(recombination)。分节段基因组病毒的基因重组(交换基因节段）称重配(reassortment)。发生几率

14、较高。,基因组不分节段的病毒的重组,基因组分节段的病毒的重配,+,（三）遗传变异意义：,1、变异使病毒逃逸免疫监视造成疾病流行2、变异使抗病毒治疗造成困难。3、变异改变了病毒抗原抗体，造成检测的困难。4、变异改变了病毒的毒力可获得减度疫苗,第三节 病毒的感染与免疫,1、水平传播(horizontal transmission),病毒在人群不同个体间的传播，称水平传播。,人群 人群,呼吸道、消化道皮肤粘膜、医源性,第一节、病毒的传播方式,2、垂直传播(vertical transmission),病毒通过胎盘或产道，直接由亲代传给子代的方式，称垂直传播。,病毒 母体 新生儿 胎盘 显 隐 胎 受

15、 先 流性 性 儿 染 天 产感 感 正 胎 畸 死染 染 常 儿 形 胎,经产道,经血,1、细胞水平的病毒感染2、整体水平的病毒感染,二 病毒的致病机制,一、细胞水平的致病机制,（1）溶细胞型感染：多见于无包膜、杀伤性强的病毒，常引起急性感染。,（2）改变细胞膜结构,为特异性抗体或CTL细胞识别,抗原,（1）细胞膜表面出现嵌合有病毒特异抗原的蛋白成分,（2）数个细胞间胞膜互相融和而形成多核巨细胞,（3）大量子代病毒的释放及机体免疫因子介导细胞死亡,（3）包涵体形成:,病毒合成的场所病毒颗粒的堆积 细胞对病毒感染的反应产物,（4）细胞增生与细胞转化,（1）细胞增生：,病毒,细胞,细胞内DNA合

16、成加快,细胞增生,可能与肿瘤的发生有关,细胞转化,病毒,培养细胞,细胞转化,细胞形态变化繁殖加快成堆生长,细胞核,（5）病毒基因的整合：,细胞核,1、逆转录病毒复制时以DNA整合入细胞染色体中；,2、失常式整合，DNA病毒多见，病毒的DNA偶而以片段整合入细胞的染色体DNA中。,(6)细胞凋亡：,诱导因子（如病毒等）,细胞,死亡基因激活,细胞膜鼓泡细胞核浓缩染色体DNA降解,电泳时有阶梯式条带,二、机体水平的致病机制,(1)病毒对免疫系统的损伤,(2)免疫复合物引起的损伤,(3)抗体增强病毒感染作用,(4)病毒感染可引起免疫应答的功能紊乱,三、病毒的感染类型,隐性感染 显性感染,急性感染 持续

17、性感染,慢性感染(chronic infection)潜伏感染(latent infection)慢发病毒感染(slow virus infection,四 抗病毒免疫,非特异性免疫特异性免疫,(一)非特异性免疫,1、遗传因素：2、宿主年龄及生理状态3、屏障作用：4、细胞作用：巨噬细胞、NK细胞等5、病毒抑制物：6、炎症反应：7、干扰素（IFN）：,1、干扰素（interferon,IFN）：,(1)概念：是个体出生后，机体受到病毒或其他干扰素诱生剂刺激巨噬细胞、淋巴细胞以及体细胞等多种细胞产生的一种糖蛋白。,(2)抗病毒特点：,A.广谱抗病毒活性，但只抑制病毒而无杀病毒功能；B.抗病毒作用有

18、相对的种属特异性，一般在同种细胞中活性最高；C.调节免疫功能；D.抑制肿瘤细胞的作用,-IFN：人白细胞产生-IFN：人成纤维细胞产生-IFN：T细胞产生,(3)种类：,型IFN,型IFN,抗病毒作用强于型,免疫调节作用强于型，称免疫IFN,(4)抗病毒作用机制：需由宿主细胞介导。,/干扰素,/干扰素,细胞的干扰素受体,细胞合成抗病毒蛋白,降解mRNA抑制多肽链延伸抑制转译,活化巨噬细胞和NK细胞,促进多种细胞MHC-I类抗原表达,IFN的诱生及抗病毒机制,干扰素,干扰素,细胞的干扰素受体,细胞合成抗病毒蛋白,降解mRNA抑制多肽链延伸抑制转译,促进多种细胞MHC-II类抗原表达,促进巨噬细胞

19、表达Fc受体，协同诱导TNF，促进巨噬细胞发挥抗病毒作用。,2、NK细胞：不受MHC限制，也不依赖抗体。,IFN等细胞因子,NK细胞,激活,识别“靶”,释放穿孔素释放/TNF，靶细胞溶酶体破坏活化靶细胞核酸内切酶，降解自体DNA,杀伤肿瘤细胞及表达抗原的自体细胞,(二)特异性免疫,病毒蛋白,活化B细胞,活化T细胞,体液免疫,细胞免疫,抗原的加工呈递,1、单核/巨噬细胞:抗原的加工与呈递,内源性抗原,蛋白酶体,CD8+T细胞,CTL杀伤病毒,清除病毒感染的主要机制,A.与MHC-I分子结合：,肽段,B、与MHC-II分子结合：,外源性抗原,溶酶体,MHC-II,CD4+T细胞,CD4+T活化,吞

20、噬溶酶体,合成和分泌大量细胞因子,辅助B细胞成熟为浆细胞,形成DTH,分泌抗体,肽段,2.体液免疫：,病毒,机体,IgM抗体：最早出现,IgG：出现晚,IgA：粘膜感染,中和抗体、非中和抗体,1、中和抗体可中和病毒的感染,作用机制：（1）改变病毒表面结构或与病毒表位结合以阻止病毒的吸附；（2）与病毒形成免疫复合物有利于巨噬细胞的吞噬和清除；（3）有包膜病毒与抗体结合后，激活补体而使病毒裂解。,激活补体,病毒裂解,有包膜病毒,2、非中和抗体：（1）因其产生抗原与病毒入侵细胞无关，故不能中和病毒的感染；（2）有时有诊断价值；（3）常见种类有：血凝抑制抗体、补体结合抗体等。,3、抗体介导对靶细胞的作

21、用,NK细胞杀伤靶细胞,ADCC作用,3.细胞免疫（特异性免疫以此为主）,病毒,机体,致敏Tc细胞（CTL）,致敏TDTH,杀伤病毒感染的靶细胞,释放多种细胞因子，直接破坏病毒或调理吞噬的功能,(1)杀伤性T细胞（CTL）：,CTL,CTL,CTL,分泌细胞毒素,靶细胞破坏,分泌穿孔素,激活靶细胞内的酶,靶细胞裂解或凋亡,病毒感染恢复的主要机制,(2)辅助性T（TH）细胞：,TH 细胞,辅助B细胞成熟为浆细胞,合成和分泌大量细胞因子,分泌抗体,活化CTL及巨噬细胞,(3)细胞因子：,CD4T细胞,病毒抗原,分泌抗病毒因子（IFN、TNF）,激活CTL、TH、巨噬细胞、NK细胞,抑制病毒复制,清

22、除靶细胞的病毒,（四）免疫病理作用,1、CTL细胞在杀伤病毒感染的靶细胞的同时，也造成了细胞的损伤，并在感染局部引起炎症反应；2、当病毒抗体亲和力底或与抗原比例不当时，可在体内形成免疫复合物的沉积而引起III型超敏反应；3、病毒感染致“隐蔽抗原”的暴露可诱发自身免疫病。,第四节 病毒微生物学检查,（一）、选择采标本的时间：1、病毒分离鉴定一般取发病初期或急性期标本；2、血清学诊断取患者早期（测IgM)和恢复期双份血液。,（二）不同病毒感染采不同标本：呼吸道感染采鼻咽分泌物；肺部感染采痰液 肠道感染采粪便；病毒血症采血液 神经系统感染采脑脊液。,一、标本的采集与送检：,一、病毒感染的检查方法,标

23、本送检：1、标本采集后应尽快送检；2、如不能及时检查，标本宜置冰壶内保存，病变组织可置于50%甘油盐水中低温保存；3、标本的长期保存应置于-70低温冰箱，或-196液氮罐中。,病毒的分离培养和鉴定：,（一）细胞培养（最常用）：,标本,原代细胞,传代细胞,细胞病变血细胞吸附PH值改变等,特异性抗体鉴定,（二）鸡胚接种,尿囊腔接种,羊膜腔接种,流感病毒,流感病毒,尿液,羊水,血凝及血凝抑制试验 鉴定病毒,（三）动物培养（少用）,流感病毒+红细胞 血凝,流感病毒+特异抗体 血凝被抑制,鸡胚接种,二、病毒感染的快速检查方法：,（一）测抗原：,标本,+,荧光标记抗体（已知）,酶标记抗体（已知）,荧光显微

24、镜观察,加底物后观察,ELISA法：乳胶凝集法：,检查病毒抗原,1、免疫荧光技术：直接法：标本+荧光标记抗体荧光显微镜观察间接法：标本+抗体+荧光标记二抗荧光显微镜观察,2、酶免疫技术：酶免疫组化法：标本+酶标抗体+酶的底物光学显微镜观察颜色变化 ELISA法：抗体或抗原（反应板）+待检抗原或抗体+酶标抗体或抗原+底物 比色计测底物颜色,测抗体（多用ELISA法）：,IgM型抗体：早期诊断价值；IgG型抗体：应用早期及恢复期双份血清，后者抗体效价是前者的4倍以上时，有辅助诊断价值；IgG型抗体（感染后期）：随访测抗体效价，如有4倍降低，有辅助诊断价值。,病毒感染的血清学诊断（双份血清）,、中和

25、试验病毒+待检血清（系列稀释）组织细胞观察CPE,、血凝抑制试验病毒红细胞（鸡、人等）血凝现象病毒待检血清红细胞（鸡、人等）血凝现象消失,病毒核酸的测定：,（一）病毒基因探针法：,1、标本,病毒基因探针（标记）,+,杂交,放射自显影生物素-亲和素系统,2、Southern印迹法,标本DNA,凝胶电泳,转移至膜上,+病毒探针,分析标本中核酸情况,多聚酶链反应（PCR）：敏感度极高,标本,提取核酸,DNA,+耐热DNA多聚酶,RNA,转录,DNA,DNA扩增,电泳,基因片段观察,第五节 病毒感染的防治原则,一.病毒感染的治疗,病毒,穿入,脱壳,核酸复制、转录 及蛋白质合成,装配,吸附,释放,一、抗

26、病毒药物,1、设计策略：以合成的异常嘧啶取代病毒DNA前体的胸腺嘧啶，病毒DNA合成时，异常嘧啶即参入到子代DNA中，阻止子代病毒基因结构的合成和表达，从而抑制病毒的复制或复制出失去感染性的病毒,DNA,疱疹净,无环鸟苷、丙氧鸟苷,2、常用药物：,毒副作用大,病毒特异性胸苷激酶磷酸化后才起作用,作为类似病毒核苷酸的底物与之竞争并抑制病毒的逆转录酶,3、病毒蛋白酶的抑制物：,(1)设计策略：以基因工程表达病毒蛋白酶后，取其结晶用X衍射及电脑模拟技术寻找酶的活性位点，然后设计出对蛋白酶活性位点的抑制剂。,(2)“鸡尾酒”疗法治疗HIV：3TC（核苷类药物）+蛋白酶抑制剂,（3）其他生物制剂：干扰素

27、、干扰素诱生剂、IL-1、TNF等；中草药：黄芪、板兰根、大青叶等。,2、抗病毒基因治疗2,1、设计策略：DNA病毒：首先选择病毒基因组的靶基因，然后设计互补的DNA片段（15-30个聚寡核苷酸），当它与病毒的关键基因结合后，就可阻抑病毒核酸的复制和转录。RNA病毒：主要通过与靶基因的mRNA互补结合后，一可阻碍mRNA与核糖体结合而阻抑病毒蛋白的转译；二则因反义RNA与mRNA结合物对核酸没敏感而被降解，间接阻断病毒蛋白质的合成。,2、存在问题：（1）合成反义DNA或RNA、核酶等所需成本高；（2）制剂不稳定易被核酸酶降解及如何使制剂能有效地到达靶基因等。,二、免疫制剂：1、抗病毒的特异免疫

28、球蛋白；2、治疗性疫苗；3、细胞因子等。,二 病毒感染的预防,(二)灭活疫苗：,(一)减毒活疫苗（首选）：,(三)、与人类病毒有交叉免疫原性的动物病毒（减毒活疫苗）；,(四)基因工程疫苗：,合成编码保护性抗原的基因片段,克隆表达于载体,细胞、真菌细菌等,大量增殖,基因重组疫苗,纯化,(五)核酸疫苗（DNA和RNA疫苗）：由载体（质粒DNA）和编码病原体某种抗原的cDNA或mRNA组成。,细胞免疫体液免疫,机体细胞,细胞表达病毒抗原,核酸疫苗,优点：便于制备、储存与运输，可诱生细胞免疫和体液免疫且维持时间长。,不足：效果不很稳定，用于人体，需较极大剂量，且需考虑安全性。,(六)、其他类型疫苗：模拟病毒表位的合成肽疫苗、抗独特型疫苗、表达多种抗原表位的联合多价疫苗等。,被动免疫：免疫血清、胎盘球蛋白、丙种球蛋白、转移因子等。,脊髓灰质炎疫苗 减毒活疫苗（人二倍体细胞、Vero细胞）麻疹疫苗 减毒活疫苗（鸡胚细胞）流行性腮腺炎疫苗 减毒活疫苗（鸡胚细胞）风疹疫苗 减毒活疫苗（人二倍体细胞）甲型肝炎疫苗 减毒活疫苗（人二倍体细胞）人用狂犬病疫苗 灭活疫苗（地鼠肾细胞）乙型脑炎疫苗 灭活疫苗（地鼠肾细胞）森林脑炎疫苗 灭活疫苗（地鼠肾细胞）乙型肝炎疫苗 基因工程疫苗（酵母菌表达）,疫苗名称 疫苗种类（培养细胞种类）,我国常见的病毒疫苗,