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1、第十章 动物实验基本技术 Animal experiment technique,基因型动物种、品系、性别等 表现型 发育环境产仔数、哺育时间、带仔数等 演出型 周围环境食物、饮水、气象条件、笼具、垫料、噪声等居住条件以及各种微生物感染等要素 实验结果 实验处理,第一节动物实验前的准备一、实验设计中应注意的问题 1动物的选择。查阅大量的文献，在前人所做工作的基础上选择与自己实验相匹配的合格动物（见实验动物的选择和应用一章）。用不合格实验动物所取得结果或者安全评价无效，所生产的制品不得使用。选择实验动物的原则相似性原则、特异性原则、适宜规格的原则、标准化原则、经济易获性原则、借鉴与法规。2造模方
2、法的选择。选择造模方法制作的模型应与人类疾病具有相似性，并且具有重复性、可靠性、适用性和可控性，另外还要经济、易行。现在各种书籍中动物模型的制作方法多种多样，但不同的实验对模型的要求不同，因此要根据自己的实验选择合适的造模方法。,二、动物及环境的准备 1.环境的准备。2.饲料的准备。3.动物的准备。,环境的准备。（1）饲养环境 必须严格控制实验动物饲养室及实验室的环境条件，主要包括温度、相对湿度、气流速度、噪声、光照度、空气洁净度、压强梯度等。饲养盒、垫料。（2）运输环境 实验动物的运输应注意包装合理，防止运输过程中微生物、寄生虫的污染；防止过于拥挤，动物窒息。长途运输还应注意保温和防止中暑。
3、不同品系、不同性别分开包装。,2.饲料的准备。直接购入成品饲料或按照有关配比自制饲料，要求所备饲料要满足动物的各个时期或不同微生物等级动物的不同需要。,3.动物的准备。实验动物来源于具有实验动物生产供应资格的科研机构或者专门的商品实验动物生产供应机构供应单位应该具有实验动物生产供应许可证（或合格证）从社会上收购的社会动物或野生动物不符合科学实验的基本要求，同时违背社会道德甚至会违背法律。,第二节 实验动物的抓取和固定 在进行实验时，为了不损伤动物的健康，不影响观察指标，并防止被动物咬伤，首先要限制动物的活动，使动物处于安静状态，工作人员必须掌握合理的抓取固定方法。抓取动物前，必须对各种动物的一
4、般习性有所了解。操作时要小心仔细、大胆敏捷、熟练准确、不能粗暴，不能恐吓动物，同时，要爱惜动物，使动物少受痛苦。,一、小鼠 小鼠性情较温顺，一般不会咬人，比较容易抓取固定。通常用右手提起小鼠尾巴将其放在鼠笼盖或其它粗糙表面上，在小鼠向前挣扎爬行时，用左手拇指和食指捏住其双耳及颈部皮肤，将小鼠置于左手掌心、无名指和小指夹其背部皮肤和尾部，即可将小鼠完全固定。在一些特殊的实验中，如进行尾静脉注射时，可使用特殊的固定装置进行固定,如尾静脉注射架或粗的玻璃试管。如要进行手术或心脏采血应先行麻醉再操作,如进行解剖实验则必须先行无痛处死后再进行。,二、大鼠 大鼠的门齿很长，在抓取方法不当而受到惊吓或激怒时
5、易将操作者手指咬伤,所以,不要突然袭击式地去抓它，取用时应轻轻抓住其尾巴后提起，置于实验台上，用玻璃钟罩扣住或置于大鼠固定盒内，这样即可进行尾静脉取血或注射。如要作腹腔注射或灌胃等操作时，实验者应戴上棉纱手套(有经验者也可不戴)，右手轻轻抓住大鼠的尾巴向后拉，但要避免抓其尖端，以防尾巴尖端皮肤脱落，左手抓紧鼠两耳和头颈部的皮肤，并将大鼠固定在左手中，右手即可进行操作。,三、家兔 家兔比较驯服，不会咬人，但脚爪较尖，应避免家兔在挣扎时抓伤皮肤。常用的抓取方法是先轻轻打开笼门，勿使其受惊，随后手伸入笼内，从头前阻拦它跑动。然后一只手抓住兔的颈部皮毛，将兔提起，用另一只手托其臀，或用手抓住背部皮肤提
6、起来，放在实验台上，即可进行采血、注射等操作。因家兔耳大，故人们常误认为抓其耳可以提起，或有人用手挟住其腰背部提起均为不正确的操作。在实验工作中常用兔耳作采血、静脉注射等用，所以家兔的两耳应尽量保持不受损伤。家兔的固定方法有盒式固定和台式固定。盒式固定适用于采血和耳部血管注射，台式固定适用于测量血压、呼吸和进行手术操作等。,正确的抓取方法,不正确的家兔抓取方法,四、豚鼠 豚鼠胆小易惊，抓取时必须稳、准、迅速。先用手掌扣住鼠背，抓住其肩胛上方，将手张开，用手指环握颈部，另一只手托住其臀部，即可轻轻提起、固定。,五、蟾蜍 抓取蟾蜍时，可先在蟾蜍体部包一层湿布，用左手将其背部贴紧手掌固定，把后肢拉直
7、，并用左手的中指、无名指及小指夹住，前肢可用拇指及食指压住，右手即可进行实验操作。抓取蟾蜍时不要挤压两侧耳部突起的毒腺，以免蟾蜍将毒液射到使用者眼睛里。需要长时间固定时，可将蟾蜍麻醉或毁脑脊髓后，用大头针钉在蛙板上。,六、狗 用狗做实验时，为防止其咬伤操作人员，一般先将狗嘴绑住。对实验用狗，如毕格狗或驯服的狗，绑嘴时操作人员可从其侧面靠近并轻轻抚摸颈部皮毛，然后迅速用布带绑住狗嘴；对家养的笨狗或未经驯服的狗，先用长柄捕狗狗夹夹住狗的颈部，将狗按倒在地，再绑嘴。如果实验需要麻醉，可先使动物麻醉后再移去狗夹。当狗麻醉后，要松开绑嘴布带，以免影响呼吸。,七、猴 饲养人员可以用网罩捕捉笼内饲养的猕猴。
8、方法是以右手持短柄网罩，左臂紧靠门侧，以防笼门敞开时猕猴逃出笼外。右手将网罩塞入笼内，由上而下罩捕。在猕猴被罩到后，应立即将网罩翻转取出笼外，将猴罩在地上，由罩外抓住猴的颈部，轻掀网罩，再提取猴的手臂反背握住，此时，猴不能逃脱。,第三节 实验动物的编号和分组,一、编号 实验动物常需要标记以示区别。编号的方法很多，根据动物的种类数量和观察时间长短等因素来选择合适的标记方法。(一)挂牌法：将号码烙压在圆形或方形金属牌上(最好用铝或不锈钢的,它可长期使用不生锈),或将号码按实验分组编号烙在栓动物颈部的皮带上，将此颈圈固定在动物颈部。该法适用于狗等大型动物。,(二)打号法：用刺数钳(又称耳号钳)将号码
9、打在动物耳朵上。打号前用蘸有酒精的棉球擦净耳朵，用耳号钳刺上号码，然后在烙印部位用棉球蘸上溶在食醋里的黑墨水擦抹。该法适用于耳朵比较大的兔、狗等动物。(三)针刺法：用七号或八号针头蘸取少量碳素墨水，在耳部、前后肢以及尾部等处刺入皮下，在受刺部位留有一黑色标记。该法适用于大小鼠、豚鼠等。在实验动物数量少的情况下，也可用于兔、狗等动物。,(四)化学药品涂染动物被毛法：,药品浓度颜色特 点 意义苦味酸 3-5%黄色 可保持2-3月 百位中性红 0.5%红色 保持时间短 十位硝酸银 2%咖啡色 光照10分钟才显色 个位,二、分组 1.分组的原则：动物分组应按随机分配的原则，使每只动物都有同等机会被分配
10、到各个实验组与对照组中去，以避免各组之间的差别,影响实验结果，特别是进行准确的统计检验,必须在随机分组的基础上进行。随机把所有的动物进行编号，然后令其双数为组（实验组），单数为B组（对照组）即可或反之。如果要分若干个组时，应该用随机数字表进行完全随机分组。,每组动物数量应按实验周期长短、实验类型及统计学要求而定。如果是慢性实验或需要定期处死动物进行检验的实验，就要求选较多的动物，以补足动物自然死亡和认为处死所丧失的数量，确保实验结束时有合乎统计学要求的动物数量存在。,2.建立对照组。分组时应建立对照组。（1）自身对照组：实验动物本身在实验处理前、后两个阶段的各项相关数据就分别是对照组和实验组的
11、实验结果，此法可排除生物间的个体差异。（2）平行对照组：平行对照组包括空白对照组、阳性对照组、阴性对照组。阳性对照组即给实验组动物使用已知有效的某种处理手段或药物；阴性对照组即与实验组采用同样的方法进行处理，但并不采用实验所要求的药物或手段（如假手术或注射生理盐水）；空白对照组则不给任何处理。,第四节 实验动物的麻醉方法,为了保障实验动物的安全，消除实验过程中所致的疼痛和不适感觉，使动物在实验中服从操作，确保实验顺利进行就要对动物进行麻醉。,一、常用的麻醉药1.常用局部麻醉剂。普鲁卡因，此药毒性小，见效快，常用于局部浸润麻醉，用时配成0.51溶液；利多卡因，此药见效快，组织穿透性好，常用0.2
12、50.5溶液做局部浸润麻醉。2.常用全身麻醉剂（1）乙醚：乙醚吸入法是最常用的麻醉方法，各种动物都可应用。乙醚麻醉的优点多，如麻醉深度易于掌握，比较安全，而且麻醉后恢复比较快。乙醚局部刺激作用大，可刺激上呼吸道黏液分泌增加，通过神经反射扰乱呼吸、血压和心脏的活动，并且容易引起窒息，在麻醉过程中要注意。需在麻醉前2030min给予一定量的基础麻醉药。,（2）戊巴比妥钠：此药麻醉时间不很长，一次给药的有效时间可延续35h，所以十分适合一般实验要求。给药后对动物循环和呼吸系统无显著抑制作用。用时配成1生理盐水溶液，必要时可加温溶解，配好的药液在常温下放置12月不失药效。静脉或腹腔注射后很快就进入麻醉
13、期，使用剂量及方法为：犬、猫、兔静脉注射3035mg/kg体重，腹腔注射4045mg/kg体重。（3）巴比妥钠：使用剂量及方法为犬静脉注射225mg/kg体重；兔腹腔注射200mg/kg体重；鼠皮下注射200mg/kg体重。,以上麻醉药种类虽较多，但各种动物使用的种类多有所侧重。如做慢性实验的动物常用乙醚吸入麻醉；对犬、猫、大鼠和小鼠的急性动物实验常用戊巴比妥钠麻醉。,二、麻醉方法1.全身麻醉。麻醉药经呼吸道吸入或静脉注射、肌肉注射，产生中枢神经系统抑制，呈现神志消失，全身不感疼痛，肌肉松弛和反射抑制等现象，这种方法称全身麻醉。,（1）吸入麻醉法：使用乙醚麻醉兔及大鼠、小鼠时，可将动物放入玻璃
14、麻醉箱内，把装有浸润乙醚棉球的小烧杯放入麻醉箱，然后观察动物。开始动物自主活动，不久动物出现异常兴奋，不停地挣扎，随后排出大小便。渐渐地动物由兴奋转为抑制，倒下不动，呼吸变慢。如动物四肢紧张度明显减低、角膜反射迟钝、皮肤痛觉消失，则表示动物已进入麻醉，可行手术和其他操作。在实验过程中应随时观察动物的变化，必要时把乙醚烧杯放在动物鼻部，以维持麻醉的时间与深度。,（2）注射麻醉法：常用的麻醉药有戊巴比妥钠、硫喷妥钠、氨基甲酸乙酯等。常采用腹腔注射、静脉注射法进行全身麻醉。在注射麻醉药物时，先用麻醉药总量的2/3，密切观察动物生命体征的变化，如已达到所需麻醉的程度，余下的麻醉药则不用，避免麻醉过深抑
15、制延脑呼吸中枢，导致动物死亡。,2.动物局部麻醉方法：常用药为普鲁卡因。在施行局部浸润麻醉时，先固定好动物，用0.51盐酸普鲁卡因皮内注射，使局部皮肤表面呈现一橘皮样隆起，称皮丘，然后从皮丘进针，向皮下分层注射，在扩大浸润范围时，针尖应从已浸润过的部位刺入，直至要求麻醉区域的皮肤都浸润为止。每次注射时，必须先抽注射器，检查有无回血，以免将麻醉药注入血管内引起中毒反应。,三、使用全身麻醉剂的注意事项1使用麻醉剂除参照一般标准外，还应考虑个体对药物的耐受性。一般说，衰弱和过胖的动物，其单位体重所需剂量较小，在使用麻醉剂过程中，随时检查动物的反应情况，尤其是采用静脉注射，绝不可将按体重计算出的用量匆
16、忙进行注射。2动物在麻醉期体温容易下降，要采取保温措施。3静脉注射必须缓慢，配制的药液浓度要适中不可过高。同时观察肌肉紧张、角膜反射和对皮肤夹捏的反应。4在寒冷冬季做慢性实验时，麻醉剂在注射前应先加热至动物体温水平。,第五节 动物除毛和给药的方法,一、除毛方法1.剪毛法。将动物固定后，先用蘸有水的纱布把被毛浸湿，再用剪毛剪紧贴皮肤剪去被毛。给犬、羊等动物采血常用此法。2.拔毛法。用拇指和食指拔去被毛的方法。在兔耳缘静脉注射或尾静脉注射时常用此法。3.剃毛法。剃毛法是用剃毛刀剃去动物被毛的方法。如动物被毛较长，先要用剪刀将其剪短，再用刷子蘸温肥皂水将剃毛部位浸透，然后再用剃毛刀除毛。本法适用于暴
17、露外科手术区。,4.脱毛法。首先将被毛剪短，然后用棉球蘸取脱毛剂，在所需部位涂一薄层，23min后用温水洗去脱落的被毛，用纱布擦干，再涂一层油脂即可。,二、给药方法注射给药:皮下、皮内、肌肉、腹腔、静脉 经口给药:口服、灌胃呼吸给药：粉尘、气雾皮肤给药：涂抹其他方法：脊髓腔、脑内、关节腔、直肠,1.注射给药法（1）皮下注射：皮下注射较为简单。一般小鼠在背部、腹部（见图10-12）或前肢腋下，给药量为0.10.3ml/10g体重。大鼠多采用在侧下腹部，豚鼠在后大腿内侧，兔在腹部或耳根部注射；蛙可在脊背部淋巴囊注射；犬多在大腿外侧注射。注意：注射时用左手拇指及食指轻轻捏起皮肤，右手持注射器将针头刺
18、入，把针尖轻轻向左右摆动，容易摆动则表明已刺入皮下，然后注射药物。拔针时，轻按针孔片刻，以防药液逸出。,小鼠皮下注射方法,大鼠皮下注射,（2）皮内注射：此法用于观察皮肤血管的通透性变化或观察皮内反应。如将一定量的放射性同位素溶液、颜料或致炎物质、药物等注入皮内，观察其消失速度和局部血液循环变化，作为皮肤血管通透性观察指标之一。方法是：将动物注射部位的毛剪去，消毒后，用皮试针头紧贴皮肤皮层刺入皮内，然后使针头向上挑起并再稍刺入，即可注射药液。注意：注射后因局部皮肤缺血，在注射部位可见皮肤表面鼓起一白色小皮丘，为防止药液外溢，最好使用棉签轻按片刻。,（3）肌肉注射：当给动物注射不溶于水而混悬于油或
19、其他溶剂中的药物时，常采用肌肉注射。肌肉注射一般选用肌肉发达、无大血管经过的部位，多选臀部。给大鼠、小鼠作肌肉注射时，选大腿外侧肌肉进行注射。注意：注射时针头要垂直快速刺入肌肉，如无回血现象即可注射。,（4）腹腔注射：先将动物固定，腹部用酒精棉球擦拭消毒，然后在左或右侧腹部将针头刺入皮下，沿皮下向前推进约0.5cm，再使针头与皮肤呈45角方向穿过腹肌刺入腹腔，此时有落空感，此法在大小鼠使用较多。注意：针头刺入腹腔后应回抽无肠液、尿液后，缓缓推入药液。,大、小鼠腹腔注射,（5）静脉注射：是将药液直接注射于静脉管内，使其随着血液分布全身，迅速发挥效用。但此注射方法排泄较快，作用时间较短。小鼠、大鼠
20、的静脉注射：常采用尾静脉注射。操作时，先将动物固定在暴露尾部的固定器内，用75酒精棉球反复擦拭使血管扩张，并可使表皮角质软化，以左手拇指和食指捏住鼠尾两侧，使静脉充盈，注射时针头尽量采取与尾部平行的角度进针。如需反复注射，尽量从尾的末端开始。一次的注射量为0.10.2ml/10g体重。开始注射时宜少量缓注，如无阻力，表示针头已进入静脉，这时用左手指将针和尾一起固定起来，解除对尾根部的压迫后，便可进行注射。如有白色皮丘出现，说明未穿刺入血管，应重新向尾根部方向移动针头再次穿刺。注射完毕后把尾部向注射侧弯曲以止血。,豚鼠的静脉注射：一般采用前肢皮下静脉。兔的静脉注射：一般采用外耳缘静脉（见图10-
21、13）。犬的静脉注射：犬的静脉注射多采用前肢外侧皮下头静脉或后肢外侧的小隐静脉。注意：将注射针头刺入静脉，回抽注射器针栓，如有回血，即可将药液缓缓注入。开始注射时宜少量缓注，如无阻力，表示针头已进入静脉，然后继续注射完毕，如有白色皮丘出现，说明未穿刺入血管，应拔出重插。,家兔耳缘静脉注射方法,犬的前肢外侧皮下头静脉,犬后肢外侧小隐静脉,犬后肢外侧小隐静脉的行走方向,2.经口给药法（1）口服法：把药物放入饲料或溶于饮水中让动物自动摄取。此法优点在于简单方便，缺点是不能保证剂量准确。一般适用于对动物疾病的防治或某些药物的毒性实验，制造某些与食物有关的人类疾病动物模型。,（2）灌胃法：在急性实验中，
22、多采用灌胃法。此法剂量准确。灌胃法是用灌胃器将所应投给动物的药灌到动物胃内。灌胃器由注射器和特殊的灌胃针构成或直接采用灌胃管。小鼠的灌胃针长约45cm，直径为1mm；大鼠的灌胃针长68cm，直径约1.2mm。灌胃针的尖端焊有一小圆金属球，金属球为中空的。焊金属球的目的是防止针头刺入气管或损伤消化道。针头金属球端弯曲成20左右的角度，以适应口腔、食道的生理弯曲度走向，见图10-17。,鼠类的灌胃法：用左手固定鼠，右手持灌胃器，将灌胃针从鼠的口腔插入，压迫鼠的头部，使口腔与食道成一直线，将灌胃针沿咽后壁慢慢插入食道，可感到轻微的阻力，此时可略改变一下灌胃针方向，以刺激引起吞咽动作，顺势将药液注入。
23、一般灌胃针插入小鼠食道深度为34cm，大鼠或豚鼠为46cm。常用灌胃量小鼠为0.21ml，大鼠14ml，豚鼠15ml。注意：在插入以后如果针头不在食管内，则动物剧烈挣扎，此时应拔出重新操作。,大鼠灌胃方法,小鼠灌胃方法,家兔灌胃用开口器及灌胃器,犬灌胃方法,猪灌胃方法,3.其他途径给药方法（1）呼吸道给药：呈粉尘、气体及蒸汽或雾等状态的药物或毒气，均需要通过动物呼吸道给药。如实验时给动物做乙醚吸入麻醉、用锯末烟雾制作慢性气管炎动物模型等，特别在毒理学实验中应用较广泛。（2）皮肤给药：为了鉴定药物或毒物经皮肤的吸收作用、局部作用、致敏作用和光感作用等，均需采用经皮肤给药方法。如兔和豚鼠常采用背部
24、一定面积的皮肤脱毛后，将一定的药液涂在皮肤上，药液经皮肤吸收。,人与动物的用药量换算方法 观察一种药物对实验动物的作用时，一个重要的问题就是给动物用多大的剂量较合适。剂量太小，作用不明显，剂量太大，又可能引起动物中毒致死。1.先用少量小鼠粗略地探索中毒剂量或致死剂量,然后用小于中毒量的剂量，或取致死量的若干分之一作为应用剂量，一般可取1/101/5。2.确定剂量后，如第一次用药的作用不明显，动物也没有中毒的表现,可以加大剂量再次实验。如出现中毒现象，作用也明显，则应降低剂量再次实验。在一般情况下，在适宜的剂量范围内，药物的作用常随剂量的加大而增强。所以有条件时，最好同时用几个剂量作实验，以便迅
25、速获得关于药物作用的较完整的资料。如实验结果出现剂量与作用强度之间毫无规律时，则更应慎重分析。,3.剂量换算的方法(1)人与动物对同一药物耐受性不同，一般动物的耐受性要比人大，单位体重的用药量动物比人要高。必须将人的用药量换算成动物的用药量。一般可按下列比例换算：人用药量：1 小鼠、大鼠：2550 兔、豚鼠：1520 狗、猫：510 以上系按单位体重口服用药量换算。如给药途径为静脉、皮下、腹腔注射，换算比例应适当减小些。,举例：一个成年人按60公斤体重,如果口服12ml，大鼠灌胃量？1260 20010000.04 0.04（25-50）=1-2ml,按动物体表面积计算的方法:人的体表面积跟体
26、重有关系,动物的体表面积也与体重有关系。动物的用药量可以通过体表面积进行换算，公式如下：AK（W2310000）A体表面积，m2 W=体重，K=常数：小鼠、大鼠9.1,豚鼠=9.8,家兔=10.1,猫=9.8,犬=11.2,猴11.8,人10.6,举例:试计算体重1.5kg家兔的体表面积？A=10.1(15002/3/10000）计算得 A0.1324m2,举例:某药物大鼠灌胃的剂量为250mg/kg,试估计狗灌胃计量？一般大鼠的体重为200g,狗体重按10kg：A大鼠=9.1(200 2/3/10000)=0.0311m2 A 狗 11.2(10000 2/3/10000)=0.5198m2
27、 大鼠250mg/kg的剂量换算成mg/m2:250 200/1000/0.0311=1608mg/m2 1608mg/m2 0.5198m2=835.8 mg(10kg狗的灌胃量）835.8 mg 10kg84mg/kg(换算成mg/kg).,第六节 实验动物的采血法一、大鼠、小鼠的采血方法剪尾采血。需血量很少时常用本法，如做红、白细胞计数、血红蛋白测定、制作血涂片等可用此法。动物麻醉后，将尾尖剪去约5mm，从尾根部向尾尖部按摩，血即从断端流出。用此法每只鼠可采血10余次。小鼠可每次采血约0.1ml，大鼠约0.4ml，见图10-22。,图10-22 小鼠尾静脉采血方法,2.眼眶后静脉丛采血。
28、穿刺采用一根特制的长710cm的硬质玻璃取血管，其一端内径为11.5mm，另一端逐渐扩大，细端长约1cm即可，将取血管浸入1肝素溶液，干燥后使用。采血时，左手拇指及食指抓住鼠两耳之间的皮肤使鼠固定，并轻轻压迫颈部两侧，使眼球充分外突。右手持取血管，将其尖端插入内眼角与眼球之间，轻轻向眼底方向刺入，当感到有阻力时即停止刺入，旋转取血管以切开静脉丛，血液即流入取血管中，见图10-23。采血结束后，拔出取血管，放松左手，出血即停止。用本法在短期内可重复采血。小鼠一次可采血0.20.3ml，大鼠一次可采血0.51.0ml。,图10-23 大鼠眼眶后静脉丛采血方法,3.股静脉或股动脉采血。大鼠经麻醉后，
29、剪开腹股沟处皮肤，即可看到股静脉，把此静脉剪断或用注射器采血即可，股动脉较深需先剥离，再采血。4.摘眼球采血。,二、豚鼠采血方法 心脏采血。用手指触摸，选择心跳最明显的部位，把注射针刺入心脏，血液即流入针管。心脏采血时所用的针头应细长些，以免发生采血后穿刺孔出血。,三、兔的采血方法1.耳缘静脉采血。将兔固定，拔去耳缘静脉局部的被毛，消毒，用手指轻弹兔耳，使静脉扩张，用针头刺耳缘静脉末端，或用刀片沿血管方向割破一小切口，血液即流出。本法为兔最常用的采血方法，可多次重复使用，如图10-25。2.心脏采血。,图10-25 家兔耳缘静脉采血法,四、犬的采血方法1.后肢外侧小隐静脉采血。后肢外侧小隐静脉
30、位于后肢胫部下三分之一的外侧浅表皮下，由前侧方向后行走。采血时，将动物固定，局部剪毛、消毒，采血者左手紧握剪毛区上部或扎紧止血带，使下部静脉充血，右手用连有6号或7号针头的注射器刺入静脉，左手放松，以适当速度抽血即可。2.前肢背侧皮下头静脉采血。前肢背侧皮下头静脉位于前脚爪的上方背侧的正前位。采血方法同上。,1.动物实验前的准备2.抓取固定3.编号分组4.麻醉方法5.除毛和给药方法6.采血方法,第八节 实验动物的处死 当实验中途停止或结束时，实验者应站在实验动物的立场上以人道的原则去处置动物，原则上不给实验动物任何恐怖和痛苦，也就是要施行安乐死。安乐死是指实验动物在没有痛苦感觉的情况下死去。实
31、验动物安乐死方法的选择取决于动物的种类与研究的课题。,1.颈椎脱臼法 2.断头法 3.击打法 4.急性大出血法 5.药物致死法 6.空气栓塞法,一、蛙类 常用金属探针插入枕骨大孔，破坏脑脊髓的方法处死。,二、大鼠和小鼠1颈椎脱臼法。2断头法。3击打法。4急性大出血法。5药物致死法。吸入一定量的一氧化碳、乙醚、氯仿等均可使动物致死。,三、犬、兔、豚鼠1空气栓塞法。一般兔、猫等静脉内注入2040ml空气即可致死。每条犬由前肢或后肢皮下静脉注入80150ml空气，可很快致死。2急性失血法。先使动物轻度麻醉，暴露股三角区，用锋利的杀犬刀在股三角区做一个横切口，把股动、静脉全切断，立即喷出血液。采用此种
32、方法，动物十分安静，对脏器无损伤，对活杀采集病理切片标本是一种较好的方法。,第九节 动物实验中应注意的问题一、数据记录 原始记录的真实、可靠性。做到这一点需要动物分组后的清晰标记；规范的工作记录程序；记录书写的清晰易辨。实验数据表格化。为了便于识别、归类、处理和分析，根据实验要求编制出数据记录表格，使数据排列一目了然，为以后的数据处理打好基础。,二、实验条件的维持 环境条件：温度、相对湿度、换气次数、噪声、光照度和洁净度。饲养管理条件：适时更换垫料、充足的食水、全价营养饲料和健全的洗刷消毒制度。异地实验条件：注意使用相匹配的运输工具和异地实验场所的环境维持。,三、动物实验的描述,在动物实验报告
33、和论文的撰写过程中，除了遵循一般实验报告和论文的撰写格式要求外，还要注意动物实验报告和论文撰写格式、内容的特殊要求等。科研论文中有关实验动物的描述：实验动物的遗传背景；实验动物的来源；实验动物的微生物等级“合格证号”；数量、性别、体重或日龄等；动物实验室条件“合格证号”。,1.种名。动物实验的论文标题一般应使用实验动物的种名，如大鼠、小鼠、犬等。在文章中第一次出现的种名需在种名后括号内用斜体注明其拉丁文学名。2.品种（系）。论文中应准确、规范描述实验动物的品种或品系名称，避免使用通俗称谓，如SD大鼠不能写成SD大白鼠，更不能简写成大白鼠，KM小鼠不能写俗称小白鼠。由于不同品种（系）的实验动物具
34、有的生物学特性不同，因此，在论文中动物一栏要写清所用实验动物的品种、品系。,3.背景资料。动物从何获得，属于遗传学分 类（近交系、突变系、封闭群、杂交F1代）中的哪一类，属于微生物分级（普通级动物、清洁动物、SPF动物、无菌动物）中的哪一级，必须在论文中描述清楚，报告中还要叙述所用动物的合格证号及颁发合格证的单位。4.规格。所用实验动物的年龄、体重、性别等规格和数量。,5.条件。论文中应对动物饲养方式（如饲料种类、营养成分、饲喂方式、饮水方式、饲养密度、笼具及垫料种类）实验观察环境（如温度、湿度、照度、噪音、环境洁净度、通风换气方式等）动物实验设施的环境条件（包括普通环境、屏障环境、隔离环境）
35、，以及相应级别的实验条件使用合格证号及颁布单位，作出尽可能的描述。6.动物实验的某些处理方式：实验处理方法的描述要准确。如灌胃、皮内注射、手术过程、技术路线等。7.其他。有关动物实验的其他描述。如麻醉剂的种类、剂量与方法，动物的处死方法等均应注明。,例1：实验采用市售健康成年家兔30只、雌雄兼用、雌者不孕,例：材料和方法 实验动物：BALB/c（nu-nu）裸鼠20只，18-22g，雌雄各半，由四川大学实验动物中心提供。动物质量许可证：川实动管第01号。实验鼠在SPF条件下饲养，饲喂 全价小鼠颗粒饲料，自由采食和饮水。实验方法：*。实验第7天，颈椎脱臼处死动物，*。,动物名称遗传背景,动物数量
36、和体重,性别,动物来源,实验饲养条件,处死方法,动物质量资料,四、动物实验标准化内容1、实验动物标准化：实验动物来源是否清楚（实验动物的提供者）、或质量是否合格（质量合格证，由实验动物供应者提供）；遗传背景（如，动物的品种、品系）；微生物控制级别（普通、清洁、SPF、无菌）；2、人员：应经过系统培训，持证上岗。3、实验操作或方法是否符合当局制定的规范及伦理或动物福利原则：实验动物选择是否适当（有专门要求或不符合“3R”原则）;动物实验的条件（环境、设施、营养、动物福利，等）；固定、动物分组标记、用药方法、麻醉、采血、处死等方法。,动物实验技术录像,第十节 现代实验动物学技术,一、试管动物培育技
37、术 试管动物（test tube animal）是指经体外受精获得早期胚胎并移植到假孕动物子宫发育而产生的动物。试管动物培育除本身的发育生物学研究意义外，还具有克服动物生殖缺陷、提高动物繁殖力、定向培育动物新品种（系）等重要意义。试管动物培育技术涉及到超数排卵、体外受精、胚胎培养与移植等技术。,试管动物培育程序:试管动物培育程序如图.,精子采集 超数排卵 假孕动物准备,精子获能 卵子采集,体外受精 胚胎移植,胚胎培养 产仔,二、转基因动物培育技术 培育转基因动物的关键技术包括：外源目的基因的制备、外源目的基因的有效导入、胚胎培养与移植、外源目的基因表达的检测等。,（1）目的基因的制备与纯化：目
38、的基因可以来源于，通过限制性内切酶预先分离的某一基因；逆转录法得到的cDNA；人工合成的DNA片段；聚合酶链式反应（PCR）扩增的特定基因片段。（2）卵供体母鼠和假孕鼠的准备。（3）超排卵与取卵，同时取精子。（4）基因显微注射。（5）受精卵移植。（6）目的基因的表达整合鉴定和检测。（7）建系。,显微注射法制备转基因小鼠的程序,另外,现在还有用逆转录病毒,腺病毒,禽痘病毒作为载体感染动物复制转基因动物模型.,三、克隆动物培育技术 1.核移植法克隆动物:细胞核移植又包括胚胎细胞核移植、体细胞核移植、干细胞核移植等。2.胚胎分割法克隆动物:将尚未着床的早期胚胎经显微手术后，分割为二、四、六若干等份，给每个受体内植入一部分胚而妊娠产仔，这样由一个胚胎可以克隆出多个遗传性能完全一样的后代个体。,
