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1、内毒素和1，3-D-葡聚糖检测的临床应用,主要内容,内毒素的来源及结构内毒素的生物学活性内毒素检测的临床应用内毒素的检测方法及参考范围检测样本的采集及影响因素,内毒素概述,内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁结构中的脂多糖（LPS），这些成分只在细菌死亡裂解后才释放到菌体外或活菌以发泡形式将其释出。,特异性多糖,核心多糖,类脂A,内毒素的结构,内毒素的生物学活性,内毒素的生物学活性,内毒素的有益作用,内毒素血症产生原因,有效的抗菌治疗后，细菌崩解,输入了含有细菌的药物、血液或者体液等。,内毒素血症临床症状主要决定于宿主对内毒素的抵抗力。症状和体征有：发热，白细胞数变化，出血倾向，心力衰竭、肾功能减退、
2、肝脏损伤、神经系统症状，以及休克、血压下降、组织灌流不足、缺氧及酸中毒等。,内毒素血症的临床症状,最严重的后果：致死性感染性休克，多器官功能衰竭，DIC等。病死率极高。,肺炎100%、尿路感染70-80%、腹腔感染72-84%、烧伤85%、急性胰腺炎90%、败血症70%、急性肝炎37-64%、暴发性肝炎58-100%、丙肝61.54%、胆石症伴急性梗阻性化脓性感染85%、多器官功能衰竭100%。,各类疾病内毒素血症的发生率,内毒素检测的临床应用,内毒素检测在医院中的应用,鲎试验是1968年由Levin和Bang建立。其原理是利用鲎的变形细胞与微量内毒素产生凝集反应的现象，作为判断试品中细菌内毒
3、素含量的一种方法。,内毒素的检测方法,内毒素的检测原理,革兰阴性菌脂多糖（内毒素）检测原理：革兰阴性菌脂多糖（内毒素）激活酶反应主剂中的相应因子后形成凝固蛋白，根据其引起的浊度变化对革兰氏阴性菌脂多糖（内毒素）浓度进行定量测定。,内毒素的检测原理,G,G,内毒素的检测方法,鲎试剂（Limulus amebocyte lysate LAL),内毒素检测的参考值,检测值10pg/ml,阴性。检测值介于1020pg/ml之间，临床观察期，建议动态采血检测。检测值20pg/ml，阳性，建议再次采血以确诊。,肝炎 败血症 肿瘤 内毒素浓度 50-320 20-1000 20-700,检测样本的采集及影响
4、因素,检测样本：血液采集要求：采样过程要求无菌操作，用专用的无热原真空采血管。常规病人早上用药治疗前空腹采血/取样（血透患者透析前采血）。样本保存：样本采集后应在3000转/分进行离心，若不能及时检测，应将血浆转移至无热原转移管内，在-30冰箱中冷冻保存，一周内使用。特殊标本处理：对一般黄疸、溶血、乳糜血标本，稀释25倍后进行检测；对于严重的黄疸、溶血、乳糜血标本，应重新采血。,影响结果的因素,产生假阳性的原因有：操作环境及操作过程中污染，应用某些抗生素类如-酰胺内酯类、喹喏酮类等患者。,MB-80微生物快速动态检测系统,(1-3)-D-葡聚糖,侵袭性真菌感染的定义,定义:指致病性真菌侵犯皮
5、下组织、黏膜、肌肉和内脏器官等所引起的真菌感染性疾病，危害性较大。,条件致病性真菌念珠菌属曲霉属其他,侵袭性真菌感染的特点,1.不产生内毒 素和外毒素 致病机理不明,4.早期症状无特异性，往往被原发病掩盖，病程长，发现较晚，死亡率高,2.致病力一般 较弱，机体免 疫低下时发生,3.感染菌种变化，白色念珠菌感染下降，曲霉菌感染增长趋势上升明显,侵袭性真菌感染（IFI）现状,IFI发生率不断增加；IFI感染病死率很高；IFI诊断困难及漏诊情况严重。,1.内源性诱因,2.外源性诱因,影响机体抵抗力的各种疾病，如白血病、癌症、结核、肺脓肿、糖尿病、肝脏疾病以及维生素缺乏等,广谱抗生素，抗肿瘤药物和免疫
6、抑制剂；,插管等侵袭性治疗，骨髓和实体器官移植；,免疫缺陷综合症,侵袭性真菌感染的诱因,国内侵袭性真菌感染不容忽视,刘正印等，中华医学杂志2003,83(5):399-402,感染人数,国内侵袭性真菌感染不容忽视,临床药物治疗杂志 2007年第5卷第1期,感染率(%),中国感染与化疗杂志2008 年7 月20 日第 8 卷第4 期,尸检研究发现，75%的侵袭性真菌感染病例在生前漏诊,诊断困难的主要原因：-临床表现不典型，易被基础疾病所掩盖-确诊常需侵入性手段获得组织标本，侵入性操作常因患者 的病情所限难以实施-真菌检测项目开展相对不足或滞后,IFI诊断困难及漏诊情况严重,主要可引发侵袭性真菌感
7、染的疾病,肺炎肺纤维症,脑出血脑梗塞硬膜下血瘤术后胸部大动脉瘤术后,糖尿病,再生障碍性贫血MODSDIC,胃癌，肝癌，肝内胆管癌，肺癌，多发性骨髓瘤，白血病，恶性淋巴瘤,肺结核腹腔内脓肿AIDS,呼吸系统疾病,感染及寄生虫病,循环系统疾病,内分泌疾病,血液及造血器官疾病,肿瘤类,侵袭性真菌感染(invasive fungal infection,IFI)的发病率逐年上升,其中又以侵袭性肺部真菌感染(invasive pulmonary fungal infection,IPF I)最常见,大约占50%60%。未经及时治疗的肺部真菌感染患者的病死率可高达30%80%。,侵袭性肺部真菌感染,临床表
8、现：缺乏特异性,多表现为发热、咳嗽、咳痰、咯血、胸闷、呼吸困难等。,现 状：两高两低一快检测方法相对滞后,早期诊断和治疗仍存在困难,副作用小的 新型抗真菌药物价格昂贵,导致病死率高。,高院内感染率和病死率低临床和实验室诊断率 患者病情恶化快,侵袭性肺部真菌感染,死亡率(%),诊断延迟时间(h),ICU诊断延迟时间与死亡率的关系,11,33,30,35,Morrell M et al.Antimicrob Agents Chemother 2005,49:36403645.,美国四大医疗中心做的一项回顾性研究,死亡率(%),诊断延迟时间(d),Garey KW et al.Clin Infect
9、 Dis 2006,43:2531.,1,3,真菌细胞膜、壁结构,羊毛固醇C14去甲基化酶14位还原和78位异构酶角鲨烯环氧化酶,1-3-D-葡聚糖本质及特点,(1-3)-D-葡聚糖特性,对热极为稳定，高压121并不能使其灭活。在念珠菌和曲霉菌细胞壁中含量较多，对G试验灵敏。,当真菌进入人体血液或深部组织后，经吞噬细胞的吞噬、消化等处理后，(1-3)-D-葡聚糖可从胞壁中释放出来，从而使血液及其它体液中含量增高。当真菌在体内含量减少时，机体免疫系统可将其清除。,在浅部真菌感染中，(1-3)-D-葡聚糖未被释放出来，故其在体液中的量不增高。,“G”试验缘何而来？,1-3-D-葡聚糖可特异性激活鲎
10、变形细胞裂解物中的G因子，引起裂解物凝固，故称G试验。,内毒素与-葡聚糖的检测比较,已知能与鲎试剂发生反应的物质有细菌内毒素和-葡聚糖，但它们的反应曲线不一样。内毒素反应曲线为S型特征曲线，而-葡聚糖反应曲线为经过0点的斜线。,内毒素和-葡聚糖与鲎试剂反应的特征曲线,侵袭性真菌感染的临床检测方法对比,科玛嘉念珠菌显色培养基的菌落颜色：,热带念珠菌-灰蓝色白色念珠菌-绿色克柔念珠菌-粉红色光滑念珠菌-紫红色其他念珠菌-白色,科玛嘉念珠菌显色培养基的菌落颜色：A/E-白色假丝酵母菌，B/C-克柔假丝酵母菌，F-光滑假丝酵母菌，D-热带假丝酵母菌,-D-葡聚糖的评价,可检测多种致病真菌感染 念珠菌，
11、曲霉，肺孢子菌，镰刀菌，地霉，组织胞浆菌，毛孢子菌等不能检测隐球菌、接合菌（根霉、毛霉、根毛霉、犁头霉等）敏感性、特异性：90左右,对于念珠菌血症,G试验检测是首选检查 J.Clin.Microbiol.2008.46:10091013.,BG值在IFI临床表现出现之前就已经高于正常值 Pazos等报道5例确诊IFI及3例临床诊断的IFI患者，发现BG值升高出现在发热、咳嗽、胸痛等症状和肺部HRCT检查发现以前。平均早于发热5 d 早于呼吸道症状平均10.7 d J Clin Microbiol，2005，43(1)：299305,G试验检测评价,Odabasi等对确诊为粒细胞缺乏人群进行为期
12、3周每周2次采血检测及临床观察发现：BG值开始高于60 pgml的时间比最后确诊为IFI或临床诊断IFI平均提前了10 d Clin Infect Dis，2004，39(2)：199205,G试验检测评价,-D-葡聚糖参考值,检测值10pg/ml,阴性。检测值介于1020pg/ml之间，临床观察期，建议动态采血检测。检测值20pg/ml，阳性(深部真菌感染)，建议再次采血以确诊。,关于G试验建议,G试验临床应用 1明确诊断（抗真菌药物治疗前）2治疗效果监测（抗真菌药物治疗后）3连续2次采血进行G试验,标本采集及保存,临床细菌内毒素及(1-3)-D-Glucan检测的国内外发展,国外：血液（包括血浆、脑脊液、血清、腹水液、尿液、唾液、乳汁等）中内毒素以及(1-3)-D-Glucan微量定量检测已经成为现实，目前在美国、日本等国均已出现专用细菌内毒素及(1-3)-D-Glucan检测仪器及配套的检测试剂盒，而且获得FDA及厚生省批准文号，作为一种日常检测项目。国内：MB-80 检测系统，为国内独家研制和生产的检测临床内毒素及(1-3)-D-Glucan的专用仪器，同时具有配套的检测试剂盒 EKT-5Mset and GKT-%M set获得SDA批准文号,谢谢,
