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1、,氯霉素眼药水的高效液相色谱分析,彭花萍,E-mail:,仪器分析实验,目的要求：,1、了解高效液相色谱的基本原理2、了解高效液相色谱仪的结构及正确使用3、学习外标法测定组分的含量,色谱起源,色谱的发明人,俄国科学家：M.S.Tswett,提出经典液相色谱,植物的石油醚提取液在碳酸钙吸附剂填充的玻璃管中分离出叶绿素及其他色素,流动相：携带样品流过整个系统的流体固定相：静止不动的一相，色谱柱,色谱法分离的基本原理：,各组分性质结构差异,与固定相相互作用差异,随流动相移动的速度不等,反复多次分配平衡(吸附解吸),保留时间不同,达到分离效果,A+B+C,A,B,C,C,B,A,C,B,A,C,C,B
2、,色谱洗脱过程与色谱图,t，min,色谱法：利用组分在两相间分配系数不同而进行分离的技术,色谱定义,色谱是一种分离技术.色谱的主要目的是对混合物中的目标物分离和定量,色谱图即色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图，其纵坐标为信号强度，横坐标为保留时间。,保留体积VR调整保留体积VR死体积V0峰面积相对保留值保留指数,V=t.Fc；Fc为流动相流速,保留值,区域宽度,W1/2=2.335W=4,W1/2W,液相色谱,按流动相与固定相的分子聚集状态分类,气相色谱,液相色谱,超临界色谱,液相色谱：以液体作为流动相的色谱分离方法适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的分析流动
3、相具有运载样品分子和选择性分离的双重作用,HPLC,是一种区别于经典液相色谱，基于仪器方法的高效能分离手段：高精度、耐高压的输液泵高性能的色谱柱高灵敏度的检测器,HPLC特点,分离性能好 灵敏度高（10-910-12 g）选择性高（同分异构，旋光异构）分析速度快 进样量小（1-100 mL）,10,HPLC应用领域,药物分析（抗生素、维生素）临床分析（药物代谢）化学品（邻苯二甲酸、醛、酮、药物中间体）环境（多环芳烃、农残、微嚢藻毒素）食品（孔雀石绿、苏丹红）生命科学（蛋白质、多肽）,液相色谱的基本流程图,流动相,高压泵,色谱柱,检测器,高压输液系统,分离系统,检测系统,记录系统,进样阀,进样系
4、统,预备柱,12,HPLC分析过程,分析前，选择适当的色谱柱和流动相，开泵，冲洗柱子，待柱子达到平衡而且基线平直后，用微量注射器把样品注入进样口，流动相把试样带入色谱柱进行分离，分离后的组分依次流入检测器的流通池，最后和洗脱液一起排入流出物收集器。当有样品组分流过流通池时，检测器把组分浓度转变成电信号，经过放大，用记录器记录下来就得到色谱图。色谱图是定性、定量和评价柱效高低的依据。,美国Agilent,美国Waters,日本岛津,常用的高效液相色谱仪,LC-15C,4.2.2 高效液相色谱主要部件,(1)泵输液系统主要部件之一，压力：1535MPa。提供高压流动相应具有压力平稳，脉冲小，流量稳
5、定可调，耐腐蚀等特性。,(2)进样装置,流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀 其结构如图所示：,泵,柱,进样,排放,泵,排放,柱,进样,六通阀是很好的定量装置，使得高效液相色谱的进样量得到准确的控制。,定量环,装填状态,进样状态,色谱柱（C18柱，ODS）,ODS柱是一种常用的反相色谱柱，也叫C18柱；由于它是长链烷基键合相，有较高的碳含量和更好的疏水性，适合分离有机物，因此在分析工作中应用的最为广泛。,常用流动相：水、甲醇、乙腈,目前最普遍的检测器测量通过溶液后的紫外或可见光光强度的损失吸光度与样品浓度呈线性关系在被测物的最大吸收波长处检测时灵敏度最大,紫外检测器,朗伯比尔定律,眼
6、药水中的氯霉素,氯霉素滴眼液 用于治疗由大肠杆菌、流感嗜血杆菌、克雷伯菌属、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌和其他敏感菌所致眼部感染，如沙眼、结膜炎、角膜炎、眼睑缘炎等。为无色或几乎无色的澄明液体。其主要成份氯霉素，辅料为硼酸、硼沙、氯化钠、防腐剂等,氯霉素,条件：需要已知浓度的标准样品 待测成分与杂质间分离良好,对照品 20ul,成份 A,样品 20uL,成份 A,峰面积A样品,峰面积A对照,外标一点法,色谱定量：峰面积与样品浓度成正比。,已知浓度的氯霉素溶液,眼药水稀释液,氯霉素含量的测定,精密吸取眼药水10mL，用7:3的水:甲醇溶液稀释至250.0mL，配制成眼药水的稀释溶液,1、对照品配
7、制（0.1mg/mL),用清洗溶剂清洗微量进样针三次，用待测溶液润洗三次，吸取待测溶液约25L，进样，记录5分钟，得色谱图。,2、眼药水样品配制,精密称取25.0mg氯霉素样品，用5mL甲醇溶解，用7:3的水:甲醇溶液稀释至250.0mL，配制成0.1mg/mL的对照品溶液,3、色谱测试,色谱条件：,色谱仪 岛津LC-15C高效液相色谱色谱柱 C18柱（5m，1504.6mm）柱温 室温流动相 甲醇水（70 30）流速 1.000ml/min波长 272nm,色谱操作步骤：,1、依次打开检测器、泵的开关2、打开电脑主机，打开操作界面3、排气泡4、设置色谱条件，打开泵开关5、让流动相冲洗色谱系统，至色谱基线水平，约半小时6、基线调零，填写数据文件名及信息7、单次运行，进样并记录数据8、数据处理及打印报告9、关氘灯，冲洗色谱系统约半小时，关机。,1、实验目的2、原理3、步骤4、数据处理5、结果讨论,实验结束后原始报告单要签字。同一组的同学交实验报告的时候放在一起，原始报告单附在末尾。,实验报告,
